[發(fā)明專利]全程C?反應(yīng)蛋白熒光免疫層析用活化熒光乳膠微球

有效

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• 申請日: 2016-09-06
• 公開（公告）號: CN106405108B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林斯
• 申請（專利權(quán)）人: 北京華科泰生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;G01N33/558;G01N33/577
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11228
• 代理人: 張秋越

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于熒光免疫層析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種全程C-反應(yīng)蛋白熒光免疫層析試紙條用的活化熒光乳膠微球及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

熒光免疫層析試紙條（試劑卡）因其快速便捷的特性，廣泛用于快檢領(lǐng)域。待測物抗體標(biāo)記熒光乳膠微球，乳膠微球在液相中存在著表面電子斥力和范德華力使得液相中的乳膠顆粒保持均勻分布。但是噴涂于玻璃纖維素膜并烘干后隨著溶液被蒸發(fā)干，表面張力推動(dòng)乳膠顆粒間無限靠近導(dǎo)致分子間斥力消失，范德華力增大，最終使得多個(gè)乳膠分子團(tuán)聚成大大小小不同的顆粒。當(dāng)免疫層析時(shí)加入樣本復(fù)溶乳膠微球時(shí)，乳膠微球不再均勻分散導(dǎo)致層析失敗。因此本領(lǐng)域多采用熒光免疫層析試劑盒，含試紙條加上樣本緩沖液。增加了檢測復(fù)雜度。或者由于乳膠微球部分凝聚，使得檢測靈敏度降低，檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。另外，乳膠微球的不穩(wěn)定，也會(huì)使得熒光試紙條的穩(wěn)定性差，不便于保存以及運(yùn)輸。

C-反應(yīng)蛋白（CRP)是一種急性相蛋白，且是在歷史上首先被認(rèn)識(shí)的急性相蛋白之一。其血清或血漿濃度的增加是由炎性細(xì)胞因子如IL-6釋放所致，它幾乎恒定不變地顯示有炎癥存在。由于C-反應(yīng)蛋白通常在細(xì)菌感染后增高，而病毒感染時(shí)不增高，所以測定人血中CRP含量對于有鑒別細(xì)菌和病毒感染重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：熒光免疫層析試紙條的熒光乳膠微球在烘干后，容易團(tuán)聚，分散不均勻，從而導(dǎo)致層析失敗或使得檢測靈敏度降低。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種全程C-反應(yīng)蛋白熒光免疫層析試紙條用的活化熒光乳膠微球及其制備，應(yīng)用該活化熒光乳膠微球制備的全程C-反應(yīng)蛋白干式熒光免疫層析試紙條，本試紙條可用于體外定量測定人血清、血漿或全血中全程C-反應(yīng)蛋白的含量。本發(fā)明的試紙條可以解決熒光乳膠微球在噴涂、烘干玻璃纖維素膜時(shí)發(fā)生團(tuán)聚的現(xiàn)象，以便制備標(biāo)記物墊，從而得到干式熒光免疫層析試紙條，無需稀釋液配置檢測試劑盒。

本發(fā)明提供的全程C-反應(yīng)蛋白熒光免疫層析用活化熒光乳膠微球的制備方法，包括如下步驟：

1）取表面活性劑加入pH為8~10的緩沖溶液中，再加入二甲基甲酰胺、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺；

2）取氨基表面的熒光乳膠微球的分散液，以緩沖溶液調(diào)pH至8~10后，加入到步驟1）所得的混合物中，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，離心去除上清液，得到活化熒光乳膠微球；

其中，所述表面活性劑為氨基酸型表面活性劑、聚乙二醇脂肪酸酯和硬脂酸鹽的混合物，三者的重量比為1~5: 1~2:0.5~3。

優(yōu)選地，所述氨基酸型表面活性劑為月桂酰谷氨酸鹽、N-酰基谷氨酸鹽或十二烷基二亞甲基氨基二甲酸鹽中的一種或其兩種以上的組合；所述硬脂酸鹽為硬脂酸的鉀、鈉、銨鹽以及三乙醇銨鹽中的一種或其兩種以上的組合。

優(yōu)選地，所述氨基酸型表面活性劑為月桂酰谷氨酸鈉；所述硬脂酸鹽為硬脂酸鈉；所述聚乙二醇脂肪酸酯為聚乙二醇單月桂酸酯。

優(yōu)選地，所述表面活性劑與所述氨基表面的熒光乳膠微球的質(zhì)量比為500~2000:1。

優(yōu)選地，步驟1）和步驟2）中所述的緩沖溶液為碳酸緩沖液；步驟2）中的攪拌反應(yīng)時(shí)間為2~4小時(shí)，溫度為20~30℃；氨基表面的熒光乳膠微球?yàn)榘被郾揭蚁晒馕⑶颉?/p>

本發(fā)明還提供上述的制備方法得到的全程C-反應(yīng)蛋白熒光免疫層析用活化熒光乳膠微球。

本發(fā)明還提供上述的全程C-反應(yīng)蛋白熒光免疫層析用活化熒光乳膠微球的標(biāo)記物工作液的制備方法：取全程C-反應(yīng)蛋白熒光免疫層析用活化熒光乳膠微球分散于微球緩沖液中，得到標(biāo)記物工作液；表面活化的熒光乳膠微球在標(biāo)記物工作液中所占的比例為0.5~2wt%；

其中，微球緩沖液的制備方法為：將BSA、生物防腐劑、雷米邦A(yù)和甜菜堿溶于0.01M、pH7.4的磷酸緩沖液中。

優(yōu)選地， BSA（牛血清蛋白）、生物防腐劑、雷米邦A(yù)和甜菜堿在所述微球緩沖液中的濃度均為0.1wt%。

本發(fā)明還提供全程C-反應(yīng)蛋白熒光免疫層析試紙條的標(biāo)記物墊的制備方法，包括如下步驟:

1）活化熒光乳膠微球標(biāo)記的兔IgG的制備：取上述制備方法得到的標(biāo)記物工作液，離心，棄上清液后，用標(biāo)記緩沖液復(fù)溶，并且同時(shí)加入碳二亞胺和兔IgG，攪拌反應(yīng)，然后離心，棄上清液，最后用標(biāo)記稀釋液復(fù)溶；