[發明專利]粘多糖貯積癥II型動物模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201610803487.6
• 申請日: 2016-09-06
• 公開（公告）號: CN106282231B
• 公開（公告）日: 2020-01-03
• 發明（設計）人: 高恩;侯增淼;李曉穎;李敏;楊小琳;趙金禮
• 申請（專利權）人: 陜西慧康生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 11276 北京市浩天知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 劉云貴;周華寧

本發明提供了粘多糖貯積癥II型動物模型的構建方法，包括針對小鼠IDS基因設計靶點，合成寡核苷酸鏈，合成的寡核苷酸鏈經退火與pUC57?T7?sgRNA質粒進行連接，獲得sgRNA表達載體；獲得小鼠受精卵；將轉錄好的Cas9mRNA和sgRNA混合均勻得到RNA混合物，將RNA混合物顯微注射至小鼠受精卵的細胞質，隨后將存活的受精卵植入雌性小鼠體內，繁殖獲得F0代小鼠；提取F0代小鼠的基因組DNA，作為模板，進行PCR反應，產物經酶切，選擇突變小鼠，從而確定Founder小鼠；Founder小鼠與野生型雄性小鼠交配獲得F1代小鼠。本發明還提供了由該方法構建的動物模型以及該模型在研究粘多糖貯積癥II型中的用途。

技術領域

本發明屬于醫學生物學技術領域，具體地，本發明涉及一種動物模型的構建方法。

背景技術

小鼠疾病模型在研究人類疾病致病機理和藥物篩選中起到了關鍵作用，特別是在評價藥物治療效果及治療方式的選擇上具有重要價值。

基因敲除是自80年代末以來發展起來的一種新型分子生物學技術，是通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。通常意義上的基因敲除主要是應用DNA同源重組原理，用設計的同源片段替代靶基因片段，從而達到基因敲除的目的。這是一項復雜的分子生物學技術，又稱為“基因打靶”技術，到目前為止，利用該技術已構建了數千種基因突變小鼠模型。然而這項傳統的基因敲除方法因流程復雜、耗時長、費用大，近些年來，大家都在尋找一種更快速、更經濟且適用性強的新方法。

粘多糖貯積癥II型(Mucopolysaccharidosis type II，MPS II，MIM309900)，又稱Hunter綜合征，是一種X連鎖隱性遺傳病，由于基因突變導致溶酶體酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在體內大量沉積，尿中大量排出硫酸皮膚素(dermatin sulfate B，DS)、硫酸已酰肝素(heparitinsulfate，HS)。患者出生時表現一般正常，但隨著越來越多的粘多糖貯積在體內，MPS II病程進行性加重，癥狀典型，預后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPS II與IDS基因發生突變高度相關。由于發病率極低，又被稱為“孤兒病”。目前，世界上該疾病的研究及治療仍比較困難。

發明內容

針對當前動物模型構建時存在的過程復雜、條件苛刻、費用巨大，以及當前粘多糖貯積癥II型研究中缺少可研究的動物模型的問題，本發明提供了一種粘多糖貯積癥II型動物模型的構建方法，由該方法獲得的動物模型，以及該動物模型在研究粘多糖貯積癥II型中的用途。

第一方面，本發明提供了一種粘多糖貯積癥II型動物模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)針對小鼠IDS基因設計靶點，合成寡核苷酸鏈，合成的寡核苷酸鏈經退火與pUC57-T7-sgRNA質粒進行連接，獲得sgRNA表達載體；

(2)獲得小鼠受精卵；

(3)將轉錄好的Cas9mRNA和sgRNA混合均勻得到RNA混合物，將RNA混合物顯微注射至小鼠受精卵的細胞質，隨后將存活的受精卵植入雌性小鼠體內，繁殖獲得F0代小鼠；

(4)提取F0代小鼠的基因組DNA，作為模板，采用包含sgRNA作用靶點的引物，進行PCR反應，產物經酶切，選擇突變小鼠，從而確定Founder小鼠；

(5)Founder小鼠與野生型雄性小鼠交配獲得F1代小鼠。

前述的構建方法，步驟(1)中合成如下兩對寡核苷酸鏈：

ms Ids E5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；