[發明專利]一種提高擴增子文庫數據均一性的文庫構建方法有效
| 申請號： | 201610801187.4 | 申請日： | 2016-09-03 |
| 公開（公告）號： | CN106283200B | 公開（公告）日： | 2018-11-09 |
| 發明（設計）人： | 易建明;屈武斌;蔡萬世;王瑞超;杭興宜 | 申請（專利權）人： | 艾吉泰康生物科技（北京）有限公司 |
| 主分類號： | C40B50/06 | 分類號： | C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京匯知杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11587 | 代理人： | 蔡倫 |
| 地址： | 102206 北京市昌平區北京市中關*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 擴增子 擴增子文庫 反應管 文庫構建 均一性 測序 擴增 引物 引物混合物 多個目標 基因測序 目標區域 起始用量 設計引物 高通量 混合物 均一化 引入 保證 | ||
1.一種提高擴增子文庫數據均一性的文庫構建方法，所述方法包括如下步驟：
1)確定多個目標區域的擴增子序列，并針對每個所述多個擴增子序列分別設計多重引物，所述多重引物的5’端含有通用序列，為測序接頭序列3’端的一部分；
2)將多重引物劃分為多個反應管，每個反應管內的多重引物滿足：
a)每個反應管內所有引物的解鏈溫度的標準差≤5℃；
b)反應管內引物的平均解鏈溫度Tprimer–二聚體的解鏈溫度Tdimer≥10℃；
c)反應管內目標擴增子引物的平均解鏈溫度Tprimer–非特異擴增子引物的解鏈溫度Tnon-specific≥10℃；
d)將擴增子之間進行兩兩比對，并對比對結果計算熱力學解鏈溫度Tpp，反應管內目標擴增子引物的平均解鏈溫度Tprimer–Tpp≥10℃；
3)計算每條引物的起始用量，使每個擴增子得到均一性擴增，得到的擴增子濃度差別不大于20％，并根據步驟2)中劃分的反應管制備每個反應管的多重引物混合物；
4)用每個反應管的多重引物混合物對目標區域序列進行第1輪擴增，得到擴增子，并將通用序列引入到擴增子的兩側；
5)對步驟4)獲得的每個反應管的擴增子進行純化和定量；
6)將所有所述反應管的擴增子進行混合，并使得各個擴增子的數目相差在10％以內；
7)以混合后的擴增子混合物為模板、以測序接頭引物進行第2輪PCR反應，將測序接頭引入到擴增子的兩側；
8)對擴增子文庫進行純化、定量、測序。
2.權利要求1的方法，其中步驟3)中得到的擴增子濃度差別不大于10。
3.權利要求2的方法，其中步驟3)中得到的擴增子濃度差別不大于5。
4.權利要求1的方法，其中步驟6)中使得各個擴增子的數目相差在5％以內。
5.權利要求1的方法，其中步驟8)中所述測序為二代測序。
6.權利要求1的方法，其中所述擴增子純化采用磁珠進行。
7.權利要求1或2的方法，其中所述測序接頭是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
8.權利要求1-6任一項的方法，其中每個反應管內所有引物的解鏈溫度的標準差≤2℃。
9.權利要求1-6任一項的方法，其中反應管內引物的平均解鏈溫度為Tprimer–二聚體的解鏈溫度Tdimer≥15℃。
10.權利要求1-6任一項的方法，其中反應管內目標擴增子引物的平均解鏈溫度Tprimer–非特異擴增子引物的解鏈溫度為Tnon-specific≥15℃。
11.權利要求1-6任一項的方法，其中反應管內目標擴增子引物的平均解鏈溫度為Tprimer–Tpp≥15℃。
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