[發明專利]檢測植原體的LAMP引物組及其試劑盒和應用

有效

• 申請號: 201610801184.0
• 申請日: 2016-09-04
• 公開（公告）號: CN106399490B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 林彩麗;王圣潔;王勝坤;田國忠;于少帥;王曦茁;汪來發;樸春根;李永;郭民偉
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 11598 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

1.檢測泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的LAMP引物組，其特征在于：由一對內引物對和外引物對組成；

其中，所述外引物對是由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的核苷酸序列組成；所述內引物對是由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列組成。

2.一種檢測泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的LAMP試劑盒，包括：LAMP引物、LAMP反應液RM、 Bst DNA聚合酶、熒光染料10×SYBR GreenⅠ、待測樣品DNA、陽性對照、陰性對照、超純水和密封液，其特征在于：所述LAMP引物為權利要求1所述的LAMP引物組。

3.一種應用權利要求2所述的LAMP試劑盒檢測泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品DNA；（2）以待檢測樣品的DNA為模板，以權利要求1所述的LAMP引物組為擴增引物，建立LAMP反應體系進行等溫基因擴增；（3）對擴增產物的結果進行判定。

4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于：所述LAMP反應體系包含：權利要求1所述LAMP引物組，LAMP反應液RM， Bst DNA聚合酶，熒光染料10×SYBR GreenⅠ，待測樣品DNA，超純水和密封液。

5.按照權利要求4所述的方法，其特征在于：所述LAMP反應體系為45μL，包含：10μM SEQID No.2和SEQ ID No.3所示的引物各 0.5μL，40μM SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的引物各1μL，2×LAMP反應液RM12.5μL，8U/μL Bst DNA聚合酶1μL，熒光染料10×SYBR GreenⅠ0.5μL，待測樣品DNA 0.5μL，超純水7.5μL和20μL密封液。

6.按照權利要求3所述的方法，其特征在于：所述等溫基因擴增為63℃恒溫反應40~60min，80℃滅活5~10 min。

7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于：所述等溫基因擴增為63℃恒溫反應60min，80℃滅活5min。

8.按照權利要求3所述的方法，其特征在于：所述步驟（3）對擴增產物的結果進行判定：將擴增產物置于恒溫熒光檢測儀或者熒光PCR儀中，實時讀取熒光信號，若出現“S”型擴增曲線則判定為陽性反應，即樣品中感染有植原體，若無“S”型擴增曲線則判定為陰性；或，在擴增產物中顯色液，在日光下，肉眼觀察反應管中顏色的變化，若擴增產物變為翠綠色則判定為陽性反應，即樣品中感染有植原體，若擴增產物仍為棕黃色則判定為陰性。

9.權利要求1所述的LAMP引物組在泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的早期診斷和病原菌的監測與鑒定中的應用。

10.權利要求2所述的LAMP試劑盒在泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑萎縮、萵苣黃化和長春花綠變植原體的早期診斷和病原菌的監測與鑒定中的應用。