[發明專利]一種炭角目菌植物內生菌及應用

有效

• 申請號: 201610795446.7
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN106591142B
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 崔秀明;楊曉艷;郭從亮;陳子明;曲媛;楊野;劉迪秋;王承瀟
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P33/20;C12R1/645
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

1.一種炭角目菌植物內生菌，其特征在于，保藏名稱為炭角目Xylarialessp；該菌株于2016年5月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNO.12248。

2.權利要求1所述的炭角目菌植物內生菌在轉化三七總皂苷制備越南參皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋參皂苷L16-的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

(1)采用常規PDB培養基或馬丁氏培養基活化培養炭角目菌植物內生菌；

(2)將步驟(1)活化后菌種接種到無菌PDB培養基進行擴大培養，接種量為質量百分比0.02％～15％，搖床培養2～5d；

(3)按三七總皂苷與乙醇溶液的質量比為1：3～1：10的比例，用體積百分比濃度為70％～75％的乙醇溶液溶解三七總皂苷，浸泡三七總皂苷10～30min后，在無菌條件下將三七總皂苷溶液倒入步驟(2)培養結束后的菌液中，繼續搖床培養6～12d，其中三七總皂苷的添加量為菌液質量的0.02％～3％；

(4)發酵培養結束后，采用超聲法破碎菌絲團，超聲時間10～30min，然后減壓抽濾分離發酵液與菌絲體，發酵液用水飽和正丁醇等體積萃取3～4次，合并上層正丁醇相，減壓蒸發濃縮，即得富含皂苷的轉化后總皂苷產物；所述炭角目菌植物內生菌在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCCNO.12248。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述步驟(1)中的采用常規PDB培養基或馬丁氏培養基活化培養炭角目菌植物內生菌具體為：

取4℃斜面保藏的炭角目菌植物內生菌進行活化培養，培養基采用PDB培養基或馬丁氏培養基，將微生物從保藏試管斜面挑取接入250ml錐形瓶中，每瓶含100ml已滅菌培養基，接菌過程在無菌環境進行；滅菌條件：121℃，20～30min；置于20～30℃，搖床培養3～5d，轉速設置在100～180r·min-1。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述PDB培養基的配制如下：取新鮮市售馬鈴薯200g，切成3～5mm見方小塊，加水1000ml加熱微沸30～50min，用4～7層紗布過濾，補足水至1L，然后添加葡萄糖20g，混勻分裝滅菌備用。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述馬丁氏培養基的配制如下：取KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，加水定容1L。

7.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

(1)采用常規PDB培養基或馬丁氏培養基活化培養炭角目菌植物內生菌Xylarialessp；

(2)將步驟(1)活化后菌種接種到無菌PDB培養基進行擴大培養，接種量為質量百分比0.02％～15％，搖床培養5～8d；，5000～12000r·min-1離心，取上清液用醇沉法分離出粗酶，然后10000～12000r·min-1離心分離獲得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸緩沖液0.1～2L的比例，用pH6.00～7.00磷酸緩沖液渦旋震蕩溶解粗酶沉淀；

(3)按三七總皂苷與乙醇溶液的質量比為1：3～1：10的比例，用體積百分比濃度為70％～75％的乙醇溶液溶解三七總皂苷，浸泡10～30min后，在無菌條件下將三七總皂苷溶液倒入步驟(2)培養結束后的粗酶沉淀的溶解液中，繼續搖床培養6～12d，其中三七總皂苷的添加量為菌液質量的0.02％～3％；然后輕輕震搖轉化1～5d，即轉化獲得富含越南參皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋參皂苷L16-的轉化后三七總皂苷。