[發(fā)明專利]特異性抑制STAT3活性的真核重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610790673.0
• 申請(qǐng)日: 2016-08-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106380522B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄒健;焦建同;邵君飛;李正;丁小鵬;張銳;殷瑩;蔣孟軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無(wú)錫市人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/85;C07K1/22;A61K38/17;A61K47/62;A61P35/00
• 代理公司: 無(wú)錫知之火專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)32318
• 代理人: 袁粉蘭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種特異性抑制STAT3活性的真核重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells，TSCs)學(xué)說(shuō)越來(lái)越受到關(guān)注。目前已經(jīng)成功在腦腫瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、皮膚癌等多種惡性腫瘤中成功分離出了腫瘤干細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為，經(jīng)藥物治療后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞殘存有密切關(guān)系。腫瘤干細(xì)胞的提出為腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)機(jī)制提供了合理解釋，對(duì)于研發(fā)更有效的抗腫瘤藥物及干細(xì)胞和細(xì)胞生物學(xué)研究均具有重大意義。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription，STAT)蛋白家族是一組被細(xì)胞因子受體激活的相關(guān)蛋白，參與增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等重要的生物學(xué)進(jìn)程。目前已知STATs家族有6個(gè)成員(STAT1-6)，其中STAT3在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)并持續(xù)活化，直接或間接調(diào)控多種癌基因從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并與腫瘤干細(xì)胞的維持和自我更新及放化療抵抗關(guān)系密切。

STAT3信號(hào)通路的激活途徑主要有三類:經(jīng)典的JAK-STAT3信號(hào)通路；受體依賴性酪氨酸激酶(RTKs)途徑；非受體依賴性酪氨酸激酶(No-receptor RTKs)途徑。當(dāng)被上游信號(hào)激活并磷酸化后，STAT3聚合成同源或異源二聚體，進(jìn)入胞核與靶基因啟動(dòng)子特定位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。正常的STAT3激活是快速而短暫的，僅維持?jǐn)?shù)分鐘到幾小時(shí)，但在多種腫瘤中存在STAT3持續(xù)性過(guò)度活化并誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的基因異常表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)許多致癌信號(hào)通路最終都集中在一套核轉(zhuǎn)錄因子上，靶向單一的轉(zhuǎn)錄因子即可阻斷一群上游基因變化引起的持續(xù)激活，轉(zhuǎn)錄因子是抑癌的理想靶點(diǎn)；STAT3是腫瘤多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路及基因調(diào)控中的“關(guān)節(jié)點(diǎn)”，因此STAT3已成為癌癥治療上最有希望的靶點(diǎn)之一。

然而，腫瘤中STAT3多呈非配體(EGF、IL-6等)依賴的組成性激活。現(xiàn)有靶向抑制劑、RNA干擾、反義寡核苷酸和誘餌寡核苷酸等單從信號(hào)通路角度抑制STAT3活化，其效果和安全性都難以達(dá)到預(yù)期，因此從內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制入手研究如何抑制STAT3在腫瘤中的異常轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性日益受到重視。

STAT3通路中重要的內(nèi)源性負(fù)性調(diào)控因子——活化STAT3蛋白抑制子3(Protein inhibitor ofactivated Stat3，PIAS3)是特異的細(xì)胞核內(nèi)STAT3抑制蛋白，它能與STAT3結(jié)合并阻斷后者與DNA結(jié)合進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)，因而在STAT3的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性上發(fā)揮“分子閘門”的作用。PIAS3的活性對(duì)于維持正常的生理和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，它通過(guò)對(duì)STAT3在內(nèi)的多種癌基因或轉(zhuǎn)錄因子活性的抑制，從而發(fā)揮抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PIAS3沉默后，STAT3活性持續(xù)增高，腫瘤細(xì)胞增殖活性顯著提高；而PIAS3上調(diào)則可抑制腫瘤的生長(zhǎng)并增強(qiáng)對(duì)化療藥物的敏感性。PIAS3與EGFR抑制劑聯(lián)合能產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。這些都提示PIAS3具有抑癌基因活性，其在腫瘤中的作用也正日益受到重視。而且，PIAS3在多種惡性腫瘤中低表達(dá)并與腫瘤細(xì)胞增殖失控和患者不良預(yù)后有關(guān)，因此在腫瘤細(xì)胞中抑制PIAS3降解有利于維持其對(duì)腫瘤中STAT3活性的抑制，從而達(dá)到抑制腫瘤的目的。

Smad6屬于Smad蛋白家族中的抑制型Smads之一。近年研究發(fā)現(xiàn)Smad6不但對(duì)BMP和TGFβ信號(hào)通路有抑制作用，而且對(duì)Wnt/β-catenin、TLR4及IL-1R/Toll樣受體、糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)通路也有調(diào)控作用。因此，Smad6參與了多種信號(hào)通路及核蛋白間的相互作用，使其在腫瘤中的作用日益受到關(guān)注，Smad6對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用往往通過(guò)蛋白相互作用并啟動(dòng)泛素蛋白酶系統(tǒng)促進(jìn)其泛素化降解。Smad6C-端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了Smad6與多種蛋白的結(jié)合，且是Smad6誘導(dǎo)結(jié)合蛋白泛素化降解不可或缺的功能域。我們研究發(fā)現(xiàn)Smad6在膠質(zhì)瘤中的促癌功能可能與其促進(jìn)PIAS3的泛素化降解從而促進(jìn)STAT3異?；罨嘘P(guān)。進(jìn)一步對(duì)Smad6蛋白結(jié)構(gòu)域研究顯示C端MH2功能域介導(dǎo)了SMAD6與與PIAS3的結(jié)合，并且是促進(jìn)PIAS3泛素化降解不可或缺的要素。而單獨(dú)構(gòu)建MH2的表達(dá)載體可阻斷SMAD6與PIAS3的結(jié)合并促進(jìn)后者(PIAS3)的穩(wěn)定性從而抑制腫瘤細(xì)胞中STAT3的活性。更重要的是MH2載體在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中顯示了其顯著的抑制腫瘤效應(yīng)。