[發明專利]腫瘤干細胞的富集和篩選方法

有效

• 申請號: 201610785096.6
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN106282117B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 艾立平;魏薇;胡清云
• 申請（專利權）人: 湖南艾佳生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.腫瘤干細胞的富集和篩選方法，其特征在于，將成球培養和免疫磁珠分離法聯合用于腫瘤干細胞的富集和篩選，具體方法如下：將腫瘤細胞在無血清的成球培養基中進行連續成球培養，并采用QPCR法同步檢測腫瘤干細胞標志物的相對表達水平，當其特異性標志物表達量處于相對最高時，輔以免疫磁珠陽性單選或雙選篩選腫瘤干細胞；

所述無血清的成球培養基的配方如下：DMEM-F12 50mL、50×B27 1mL、100ng/mL表皮生長因子10μL、100ng/mL人堿性成纖維生長因子10μL、20% BSA 1mL、1mg/mL胰島素20μL、青鏈霉素500μL、100mM左旋谷氨酰胺1mL；其中，所述青鏈霉素為10000U/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素的混合液；

成球培養包括以下步驟：

S11、培養腫瘤細胞至80~90%滿瓶，消化收集細胞，單細胞懸液接種到6孔超低吸附細胞培養板中，接種密度為5×10⁴-8×10⁴個/孔，每孔加入2-2.5mL SFMD培養液，在37℃、5%CO₂細胞培養箱中培養48h-96h，得到P1代成球細胞；

S12、于37℃、5%CO₂細胞培養箱中，向培養液中加入0.05%的胰酶消化液消化細胞5-8min，待腫瘤球松散后，每孔加2-2.5 mL SFMD培養液終止消化，吹打均勻，按5×10⁴-8×10⁴個/孔的細胞密度接種到新的6孔超低吸附細胞培養板中在37℃、5%CO₂條件下進行P2代成球培養，培養48h-96h，得到P2代成球細胞；

S13、重復上述步驟S12，培養下一代成球細胞；

S14、對于得到的每一代腫瘤成球細胞，采用QPCR法檢測腫瘤干細胞標志物的相對表達量，同時設置親本腫瘤細胞為對照；

S15、根據腫瘤干細胞標志物的相對表達含量，確定干性最強的Pn代成球細胞，并將細胞成球擴大培養至Pn代成球細胞滿足磁珠篩選的起始數目要求；

利用免疫磁珠陽性單選篩選腫瘤干細胞的方法如下：

S21、將成球細胞消化成10⁷個/mL單細胞懸液，1300-1350r/min離心5-6 min，棄上清；

S22、向細胞沉淀中加適量預冷的緩沖液重懸細胞；1300-1350r/min 離心5-6 min，棄上清；向每10⁸個細胞中加入300μL緩沖液重懸細胞，并向其中加入100μL FcR BlockingReagent，混勻，然后加入100μL被特定腫瘤干細胞標志物抗體預包被的MicroBeads；混勻，2~8℃孵育30min；然后向其中加入1mL緩沖液，1300-1350r/min 離心5-6 min，棄上清；向每10⁸個細胞中加入500μL緩沖液重懸細胞，得細胞懸液；

S23、過柱前，用緩沖液沖洗分離柱，然后將上述細胞懸液加樣至分離柱，用緩沖液洗柱3~5次，并加壓將抗體陽性細胞沖洗至離心管中；

S24、將收集得到的抗體陽性細胞于1300-1350r/min離心5-6 min，向其中加入相應的熒光標記抗體，混勻，2~8℃孵育10-12min，并于1h內上流式細胞儀進行流式檢測；流式檢測結果為陽性后，用SFMD培養液擴大培養分選獲得的抗體陽性細胞，即得腫瘤干細胞；

利用免疫磁珠陽性雙選篩選腫瘤干細胞的方法如下：

S31、將成球細胞消化成約10⁸個/mL單細胞懸液，1300-1350r/min離心5-6 min，棄上清；

S32、向細胞沉淀中加適量預冷的緩沖液重懸細胞；1300-1350r/min離心5-6 min，棄上清；向每10⁸個細胞中加入300μL緩沖液重懸細胞，并向其中加入100μL FcR BlockingReagent，混勻，然后加入100μL被特定腫瘤干細胞標志物I抗體預包被的MicroBeads；混勻，2~8℃孵育30min；然后向其中加入1mL緩沖液，1300-1350r/min離心5-6 min，棄上清；向每10⁸個細胞中加入500μL緩沖液重懸細胞，得細胞懸液；

S33、過柱前，用緩沖液沖洗分離柱，然后將上述細胞懸液加樣至分離柱，用緩沖液洗柱3~5次，并加壓將I抗體陽性細胞沖洗至離心管中；

S34、將收集得到的抗體陽性細胞于1300-1350r/min離心5-6 min，向其中加入相應的熒光標記抗體，混勻，2~8℃孵育10-12 min，并于1h內上流式細胞儀進行流式檢測；流式檢測結果為陽性后，用SFMD培養液擴大培養分選獲得的I抗體陽性細胞；

S35、將上述擴大培養得到的I抗體陽性細胞于1300-1350r/min離心5-6 min，棄上清；

S36、向細胞沉淀中加適量預冷的緩沖液重懸細胞，得到10⁷個/mL細胞懸液；1300-1350r/min離心5-6 min，棄上清；向每10⁷個細胞中加入300μL緩沖液重懸細胞，并向其中加入100μL FcR Blocking Reagent，混勻，然后加入100μL被特定腫瘤干細胞標志物II抗體預包被的MicroBeads；混勻，2~8℃孵育30min；然后向其中加入1mL緩沖液，1300-1350r/min離心5-6 min，棄上清；向每10⁷個細胞中加入500μL緩沖液重懸細胞，得細胞懸液；

S37、過柱前，用緩沖液沖洗分離柱，然后將上述細胞懸液加樣至分離柱，用緩沖液洗柱3~5次，并加壓將II抗體陽性細胞沖洗至離心管中；

S38、將收集得到的抗體陽性細胞于1300-1350r/min離心5-6 min，向其中加入相應的熒光標記抗體，混勻，2~8℃孵育10-12 min，并于1h內上流式細胞儀進行流式檢測；流式檢測結果為陽性后，用SFMD培養液擴大培養分選獲得的II抗體陽性細胞，即得腫瘤干細胞；

所述SFMD培養液的配方如下：DMEM-F12 50mL、50×B27 1mL、100ng/mL表皮生長因子10μL、100ng/mL人堿性成纖維生長因子10μL、20% BSA 1mL、1mg/mL胰島素20μL、青鏈霉素500μL、100mM左旋谷氨酰胺1mL；其中，所述青鏈霉素為10000U/mL青霉素和10mg/mL鏈霉素的混合液。