[發明專利]一種通過飼料實際制粒評價植酸酶的耐溫抗逆性能的方法

有效

• 申請號: 201610767420.1
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN106323964B
• 公開（公告）日: 2019-03-05
• 發明（設計）人: 蘇俊兵;郭寶林;蔡曉龍
• 申請（專利權）人: 北京昕大洋科技發展有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種通過飼料實際制粒評價植酸酶耐溫抗逆性能的方法，包括以下步驟：

1)空白制粒后補加植酸酶樣的制備和酶活測定：不添加植酸酶，在按照飼料配方要求制粒和取樣之后，再混合植酸酶得到待測樣品，測定待測樣品的酶活和水分含量，算出酶活平均值A，單位為：U/g和水分平均值B，單位為：質量百分比％，然后計算絕干樣品酶活平均含量C，計算公式為：C＝A/(1-B)；

2)成品顆粒飼料樣的制備和酶活測定：按照飼料配方要求進行制粒和取樣以得到待測樣品，測定待測樣品的酶活和水分含量，算出酶活平均值D，單位為：U/g和水分含量平均值E，單位為：質量百分比％，然后計算絕干樣品酶活含量F，計算公式為：F＝D/(1-E)；

植酸酶存留率(％)計算：植酸酶存留率(％)＝絕干樣品酶活含量F/絕干樣品酶活含量C×100％；

酶活測定方法為分光光度法，樣品檢出范圍為0.1-50U/g；在415nm下測定吸光度，且吸光度顯示范圍-0.301A-4.000A。

2.根據權利要求1所述的通過飼料實際制粒評價植酸酶耐溫抗逆性能的方法，其特征在于，酶活測定方法，包括如下步驟：

(1)繪制標準曲線

準確稱取0.3402g在105℃烘至恒重的基準磷酸二氫鉀于500mL容量瓶中，用乙酸緩沖液溶解，并定容至500mL，濃度為5.0μmol/mL，用乙酸緩沖液分別稀釋為：5μmol/mL、2.5μmol/mL、1.25μmol/mL、0.625μmol/mL、0.3125μmol/mL、0.15625μmol/mL不同濃度基準待反應液，與待測試樣一起反應測定；以吸光值為橫坐標，反應體系中的無機磷濃度量，單位：μmol/mL為縱坐標，列出直線回歸方程：y＝ax+b；

(2)試樣溶液的制備：

按照建議稱樣量，稱取添加植酸酶的飼料試樣兩份，精確至0.0001g，置于200mL刻度錐形瓶中，加入乙酸緩沖液100.0mL，在超聲波溶解器上超聲溶解15min，再放入回旋式振蕩器中振蕩30min；然后在離心機上以4000r/min離心10min，用注射器抽取上層漂浮物和底部沉淀物之間的清液，先用規格25mm×0.45μm的一次性水系針頭濾器過濾，然后用規格13mm×0.22μm的一次性水系針頭濾器過濾；分取不同體積的過濾后清液，根據估計樣品酶活濃度，用乙酸緩沖液稀釋，使試樣溶液的酶活濃度保持在0.04U/mL左右，為待反應液；

所述建議稱樣量

(3)反應

取10mL試管按下面的反應順序進行操作，標準空白加入2mL乙酸緩沖液；在反應過程中，從加入底物溶液開始，向每支試管中加入試劑的時間間隔要保持一致，在恒溫水浴中37℃水解30min；

反應步驟及試劑、溶液用量見下表；其中樣品空白反應測定順序中，需要第7步和第4步互換；

反應步驟及試劑、溶液用量

反應順序	樣品、標準	樣品空白
1.加入待反應液	2mL	2mL
2.混合	√	√
3.37℃預熱5min	√	√
4.依次加入底物溶液	4mL	4mL
5.混合	√	√
6. 37℃水解30min	√	√
7.依次加入酶反應終止及顯色液	4mL	4mL
8.混合	√	√
總體積	10mL	10mL

(4)樣品測定

反應后的試樣在室溫下靜置10min，如出現混濁需在離心機上以4000rpm離心10min，上清液以標準曲線的空白調零，在分光光度計415nm波長處測定試樣空白A0和試樣溶液A的吸光值，A-A0為實測吸光值；用直線回歸方程計算植酸酶的活性；

(5)結果計算

試樣中植酸酶活性以X表示，單位為酶活性單位：U/g，按式(1)計算

式中：

X——試樣中植酸酶的活性，單位為酶活性單位：U/g；

y──根據實際樣液的吸光值由直線回歸方程計算出的無機磷的量，單位為：μmol；

t──酶解反應時間，單位為：min；

n──試樣的稀釋倍數；

m──試樣的量，單位為：g；

所述乙酸緩沖液，c(CH₃COONa·3H₂O)＝0.25mol/L：稱取20.52g無水乙酸鈉，0.5g曲拉通X-100，0.5g牛血清白蛋白于1000mL燒杯中，加入900mL水攪拌溶解，用冰乙酸調節pH值至5.5±0.01，再轉移至1000mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度；室溫下存放2個月有效；

所述底物溶液，c(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)＝7.5mmol/L：稱取0.69g肌醇六磷酸鈉，所述肌醇六磷酸鈉分子式為C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂，分子量為923.8，純度為95％，精確至0.1mg，置于100ml燒杯中，用約80ml乙酸緩沖液溶解，用冰乙酸調節pH至5.5±0.01，轉移至100mL容量瓶中，并用乙酸緩沖液定容至刻度，現用現配；

所述酶解反應終止及顯色液：移取2份硝酸溶液，1份鉬酸銨溶液，1份偏釩酸銨溶液混合后使用，現用現配；

所述硝酸溶液：1份濃硝酸+2份水；

所述鉬酸銨溶液，100g/L：稱取10g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O于50mL燒杯中加熱溶解，必要時可微加熱，再轉移至100ml容量瓶中，加入25％濃度的氨水1.0mL，用水定容至刻度；所述氨水濃度為質量百分比；

所述偏釩酸銨溶液，2.35g/L：稱取0.235g偏釩酸銨(NH₄VO₃)于50mL燒杯中，加入2mL硝酸溶液及少量水，并用玻璃棒研磨溶解，再轉移至100mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度；避光條件下保存一周內有效。