[發明專利]臍帶間充質干細胞上清液的收集方法

在審

• 申請號: 201610766785.2
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN107779430A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 孟歡;馬潔;樓敏銘;葛恒翠;王宏偉;程騰
• 申請（專利權）人: 天津市康婷生物工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司12209
• 代理人: 趙瑤瑤

技術領域

本發明屬于生物技術領域，主要應用于臨床患者皮膚創面的治療，尤其是一種臍帶間充質干細胞上清液的收集方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cells)MSCs是一類來源于早期中胚層，具有高度自我更新和多向分化能力的一類多能干細胞，由于其良好的自我分化、免疫調節和強大的抗炎能力，在臨床治療方面越來越多的受到專家的重視。經研究表明，MSCs具有自分泌和旁分泌功能，能夠在局部分泌多種蛋白，引導細胞的遷移、分化，改善局部供血功能、消除局部炎癥反應。MSCs分泌的活性蛋白主要涉及促細胞遷移類、受體類、促細胞分化類、調節類和血管生成等幾類。這些不同種類的活性蛋白在改善修復靶器官組織功能、抗炎、抗凋亡、免疫調節等方面發揮了重要的作用，是其重要的治療機制之一。因此，除了上述的臨床治療，MSCs在治療難愈性創面和皮膚病方面發揮著明顯的治療作用，有非常好的治療效果。

由于新鮮MSCs制劑在保存液中存活24h后開始出現凋亡，因此制備成品后需要迅速運輸至臨床為患者使用，否則無法獲得治療效果，這使MSCs在臨床的應用受到局限。MSCs主要通過分泌機制來實現對創傷的修復，而MSCs培養液中含有大量的分泌因子，因此用MSCs的上清液可以進行替代MSCs制劑的治療。為此，尋找一種制備簡便，可長時間保存的上清液制備方法成為必要。

現有技術存在的缺陷：目前收集MSCs上清液多采用收集不斷傳代后的細胞培養上清進行混合。細胞培養上清需要加入血清，細胞才能夠貼壁增殖，所以上清液中含有外源性血清。而外源性血清是皮膚致敏的主要致敏原，如果將這種上清液涂抹于皮膚上，尤其是有嚴重創面的皮膚，失去表皮與真皮的保護，會有一定程度的過敏風險。上清液中的細胞因子全部由細胞分泌，因此細胞的生長狀態尤為重要。細胞生長狀態佳，分泌細胞因子的含量就會提高，保證細胞最佳的生長狀態是重要的一個環節。目前培養細胞多用DMEM/F12培養基，細胞狀態完全依賴于原代細胞狀態，經過不斷的傳代，細胞狀態也會隨之衰減，影響細胞因子的分泌量。細胞因子屬于一種蛋白質，在常溫狀態下很不穩定，光照、氧化、溫度都會使其降解，失去促細胞增殖作用。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種臍帶間充質干細胞上清液的制備方法。本方法去除了易致敏的外源性血清，改用無血清培養基饑餓培養收集上清液。本方法加入人參皂苷這種中藥提取成分，提高細胞生物活性，增加細胞因子的分泌量，同時人參皂苷自身可促進細胞增殖，有助于難愈性創面的愈合，使得治療效果倍增。本方法將細胞上清液制備成凍干粉，有助于上清液長期的保存和使用。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種臍帶間充質干細胞上清液收集方法，方法由下列步驟組成

⑴取足月產健康剖腹產胎兒臍帶，取出放置燒杯中用PBS反復沖洗干凈，去除殘留在臍帶上的血液，獲得干凈臍帶；

⑵將臍帶的靜脈和動脈血管用器械鈍性分離出來；

⑶將剩余的沃頓氏膠剪成0.5-1cm左右小段，用鑷子放入無菌燒杯中；

⑷將燒杯中的臍帶小段剪碎成大小為1mm³以下的組織塊；

⑸將組織塊轉移至無菌培養瓶中，均勻平鋪在瓶底，放置于CO₂培養箱中干燥1小時；

⑹向每個培養瓶中加入含血清的DMEM/F12培養基10ml，37℃，5％CO₂靜置培養；

⑺6天后換液，以后每5天全量換液一次，待細胞融合度達到80％進行傳代；

⑻用PBS沖洗培養瓶，吸棄組織塊，每瓶加入胰蛋白酶，消化3-5分鐘后，用血清終止消化；

⑼收集終止后的消化液，1000rpm，5min離心，吸棄上清液，收獲間充質干細胞；

⑽將間充質干細胞按照8000個/cm²進行接種，約每3天傳代一次；

⑾間充質干細胞傳至P5代時吸棄原培養基，PBS沖洗瓶底，加入不含酚紅的無血清DMEM/F12培養基，同時按照20μg/ml的濃度加入配制好的人參皂苷饑餓培養；

⑿饑餓培養72小時后收集細胞上清液，4000g，20min離心；

⒀收集離心后的上清液，0.22μm濾器過濾，將濾液收集到無菌收集管中，-80℃冷凍，后將冷凍凝固的上清液抽真空，生化干燥，制備出凍干粉，-20℃冷凍保存。

而且，所述的步驟⑷中將臍帶機械剪碎的工具為剪刀。

而且，所述的步驟⑸中無菌培養瓶為75cm²培養瓶。