[發(fā)明專利]高效擴增人外周血NK細胞的實驗方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610766712.3 | 申請日： | 2016-08-30 |
| 公開（公告）號： | CN107779434A | 公開（公告）日： | 2018-03-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 周瑤;馬潔;趙剛;馮鄲;許蕊;翟雷壘 | 申請（專利權(quán)）人： | 天津市康婷生物工程有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/0783 | 分類號： | C12N5/0783 |
| 代理公司： | 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司12209 | 代理人： | 趙瑤瑤 |
| 地址： | 300200 天津市西青區(qū)西青經(jīng)*** | 國省代碼： | 天津;12 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 高效 擴增 人外周血 nk 細胞 實驗 方法 | ||
1.一種高效擴增人外周血NK細胞的實驗方法，其特征在于：步驟如下：
⑴將外周血離心800g，10min，離心采用8升4降的方式，取上清56℃滅活30min，離心2000g，10min，離心采用8升8降的方式，取上清作為自體血清；
⑵用生理鹽水倍比稀釋血液，將重懸后液體緩慢加注于裝有ficoll分離液的離心管中，F(xiàn)icoll與液體比例＝3：4體積比，離心600g，40min，離心采用1升0降的方式；
⑶吸取白膜層，用生理鹽水沖洗，離心400g，10min，離心采用8升4降的方式，重復(fù)兩次，生理鹽水重懸計數(shù)，取一定量細胞做流式檢測分析細胞初始分選后CD3-/CD56+細胞所占比率，
⑷用培養(yǎng)基KBM501調(diào)節(jié)細胞濃度，以細胞終濃度為2×106個/mL接種在細胞中加入額外添加細胞因子IL-15為10-50U/mL，CD3為0.5-500ng/mL，CD16為50-100ng/mL和5％自體血清，置于空氣CO2含量為5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，
⑸培養(yǎng)至D3-D5天，混勻計數(shù)，水平離心，轉(zhuǎn)速300g，時間5min(9升9降)，離心后去上清，用不含細胞因子的KBM501培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度，培養(yǎng)基含5％自體血清，以細胞終濃度為1.5×106個/mL接種，置于CO2含量為5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，
⑹培養(yǎng)至D7天，將D3-D5去除細胞因子后培養(yǎng)的NK細胞吹懸混勻計數(shù)，取2×106個細胞用于流式檢測NK表型(CD3-/CD56+)，將剩余細胞轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，水平離心，轉(zhuǎn)速300g，時間5min，離心采用9升9降的方式，去除原有培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為：KBM501：KBM502＝1:1，含1％自體血清，調(diào)節(jié)細胞濃度，以細胞終濃度為1.5×106個/mL接種，置于CO2含量為5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，
⑺培養(yǎng)至細胞數(shù)目滿足要求水平離心，轉(zhuǎn)速300g，時間5min，離心采用9升9降的方式，離心后去上清，用15ml生理鹽水重懸細胞，水平離心，轉(zhuǎn)速300g，時間5min，離心采用9升9降的方式，離心后去上清，重復(fù)4次，用40ml生理鹽水重懸細胞，80目細胞篩過濾細胞至50ml離心管中，計數(shù)，水平離心，轉(zhuǎn)速300g，時間5min，離心采用9升9降的方式，離心后去上清，用20ml注射器從100ml生理鹽水瓶中抽取20ml生理鹽水重懸細胞，用20ml注射器將細胞懸液轉(zhuǎn)移至原瓶中，
培養(yǎng)14天的時間，細胞總數(shù)擴增100-500倍，其中NK細胞數(shù)目擴增1000-3000倍。
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