[發明專利]一種發酵液中提取純化他克莫司的方法

有效

• 申請號: 201610752874.1
• 申請日: 2016-08-29
• 公開（公告）號: CN106478664B
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 徐會根;羅定軍;黃智勇;徐殿勝;李耀榮;熊志;葉家雄;陳繼敏;朱敏杰
• 申請（專利權）人: 廣東藍寶制藥有限公司
• 主分類號: C07D498/18
• 分類號: C07D498/18
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司44416
• 代理人: 張帥

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，尤其涉及一種發酵液中提取純化他克莫司的方法。

背景技術

他克莫司(Tacrolimus)又名普樂可復，為白色或類白色結晶體，化學式為C44H69NO12·H2O，分子量為822.05，易溶解于乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯和氯仿，幾乎不溶于水。他克莫司是由日本藤澤制藥公司率先提取得到的一種真菌代謝產物，屬于免疫抑制性大環內酯類藥物。

現代工業主要采用筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)、鏈霉菌等進行微生物發酵，進而進行提取純化獲得他克莫司。由于他克莫司的結構復雜，發酵液中還含有他克莫司類似物，如子囊霉素和二氫他克莫司，因此，難以通過常規的純化技術純化得到高純度的他克莫司，通常需要通過硅膠柱層析進行純化。

中國專利申請CN101712686公開了一種發酵液中他克莫司的分離純化方法，包括過濾收集菌體、有機溶劑浸提菌體、大孔樹脂吸附、萃取濃縮、硅膠柱層析等步驟，使用含乙酸乙酯的正己烷溶液、含乙酸乙酯的環己烷溶液、含丙酮的正己烷溶液、含丙酮的環己烷溶液、含乙醇的正己烷溶液或含乙醇的環己烷溶液作為硅膠柱層析的洗脫液，雖然得到的他克莫司純度高達95.8％，但仍無法達到原料藥的要求。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，發明人通過大量試驗對大孔樹脂柱和硅膠柱的操作條件進行摸索，預料不到地發現：通過添加一定量的醋酸，以正己烷、乙酸乙酯和醋酸組成的洗脫組合物進行洗脫，可以實現他克莫司與他克莫司類似物的高效分離，提高了他克莫司的純度。基于上述發現，從而完成本發明。

發明人通過色譜檢測發現，目標產物他克莫司是一水化合物，易在含水溶媒中形成互變異構體。由于大孔樹脂的流動相往往需要使用水作為溶劑，對此，發明人對大孔樹脂柱的柱溫進行考察，令發明人驚奇的是：通過降低大孔樹脂柱的柱溫至16～19℃，可以避免他克莫司的互變異構體形成，解吸液中檢測不到他克莫司的互變異構體，減少了他克莫司的損失，提高了他克莫司的收率和純度。

本發明提供一種發酵液中提取純化他克莫司的方法，包括如下步驟：

S1發酵液的固液分離：向發酵液中，加入過濾助劑，攪拌，過濾，收集濾渣；

S2丙酮浸提：向所述濾渣中以3～8mL/g濾渣的比例加入丙酮，超聲提取2～3次，過濾并合并濾液，得到浸提液；

S3浸提液濃縮及大孔樹脂處理：將所述浸提液減壓濃縮得到第一濃縮液，經大孔樹脂柱床吸附，大孔樹脂柱床與第一濃縮液的體積比為1：4～8，使用4～8倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度30～45％的丙酮溶液進行沖洗，柱床溫度為16～19℃，然后使用0.5～2倍大孔樹脂柱床體積的體積濃度65～80％的丙酮溶液進行解吸，收集解吸液；

S4解吸液處理：將所述解吸液減壓濃縮得到第二濃縮液，加入第二濃縮液2～4倍體積的乙酸乙酯萃取2～3次，減壓濃縮得到油狀物，加入油狀物1～3倍體積的正己烷溶解，得到待層析液；

S5硅膠柱層析：將所述待層析液上硅膠柱層析，柱溫18～22℃，使用正己烷、乙酸乙酯和醋酸組成的洗脫組合物進行洗脫，收集層析液；

S6層析液處理：將所述層析液減壓濃縮得到第三濃縮液，加入第三濃縮液2～4倍體積的乙酸乙酯萃取2～3次，加入乙酸乙酯體積4～5％的正己烷，冷卻至1～10℃析晶，收集晶體，真空干燥，得到他克莫司。

優選地，所述洗脫包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以3～5：2～3：0.1～0.4的體積比組成的組合物4～6倍柱體積，正己烷、乙酸乙酯和醋酸以1～2：3～5：0.1～0.4的體積比組成的組合物8～15倍柱體積。

更優選地，所述洗脫包括：正己烷、乙酸乙酯和醋酸以4：2：0.2的體積比組成的組合物5倍柱體積，正己烷、乙酸乙酯和醋酸以2：4：0.2的體積比組成的組合物12倍柱體積。

優選地，所述超聲的頻率為35～40kHz，時間為20～30min。

優選地，所述大孔樹脂為非極性大孔樹脂。具體的如非極性大孔樹脂D4020、非極性大孔樹脂LX1180等。

優選地，所述過濾助劑包括：0.5～2％(w/v)的硫酸鋅、0.5～2％(w/v)的無水氯化鈣和1～5％(w/v)的硅藻土，以發酵液體積計。

優選地，所述減壓濃縮的溫度為35～55℃。

優選地，所述析晶的溫度為3～6℃。