[發明專利]親和配基、構建方法、親和層析介質、制備方法及應用

有效

• 申請號: 201610749025.0
• 申請日: 2016-08-29
• 公開（公告）號: CN106317227B
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 夏海鋒;王姝婧;王玉君
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/66;B01J20/24;B01J20/30;B01D15/38;C07K1/22
• 代理公司: 南京禹為知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 王曉東

1.一種親和配基，其特征在于：親和配基的構建是在對NpuDnaE-N，即IN的結構進行改造 的基礎上進行的，改造后的IN片段命名為IN*；其中，

天然IN的C端添加一個半胱氨酸，用于與層析微球的共價結合；

天然IN的N端首位氨基酸引入突變Cys1Ala，避免N端斷裂反應的發生；

His-tag置于天然IN片段的N端，用于純化配基片段；

所述His-tag置于天然IN片段的N端，突 變Cys1Ala，天然IN的C端添加一個半胱氨酸，其基因序列如序列表SEQ ID No.4所示，其蛋 白質序列如序列表SEQ ID No.6所示。

2.一種如權利要求1所述的親和配基的構建方法，其特征在于：對天然斷裂型 內含肽NpuDnaE的N端剪接結構域進行分子改造，改造后的IN片段命名為IN*，包括，

在天然IN的C端添加一個Cys；

在IN片段的N端添加His-tag序列；

在引物中添加Nde I、Hind III兩個酶切位點并利用其將IN*片段插入表達載體pET28a， 獲得的蛋白即為親和配基片段。

3.根據權利要求2所述的親和配基的構建方法，其特征在于：所述引物，其中，IN*序列改 造的上、下游引物基因序列分別如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

4.根據權利要求2或3所述的親和配基的構建方法，其特征在于：還包括，

重組菌的構建，以pRSFDuet-1-NpuDnaE質粒為模板進行PCR，獲得改造后的片段IN*，利用載體pMD19-T構建重組質粒pMD19-T-IN*，轉化感受態E.coli JM109，然后利用Nde I和Hind III兩個酶切位點將構建好的IN*序列與表達質粒pET-21b進行酶切連接，得到重組表達質粒pET-21b-IN*，最后轉化感受態E.coli BL21(DE3)，得到改造后的重組IN*表達菌株E.coli BL21(DE3)/pET-21b-IN*；

NpuDnaEIN*的表達純化，對重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-21b-IN*進行誘導表達，獲得 改造后的重組IN*蛋白。

5.根據權利要求4所述的親和配基的構建方法，其特征在于：與重組IN*蛋白相配對的IC-GFP片段的基因序列和蛋白質序列如序列表SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示。

6.一種利用如權利要求1所述的親和配基偶聯得到的親和層析介質，其特征在 于：以IN*片段為親和配基，通過活化中間臂共價偶聯到瓊脂糖微球，形成對IC融合蛋白具有 親和作用的親和層析介質，其結構為瓊脂糖微球-活化中間臂-IN*親和配基：

。

7.一種如權利要求6所述的親和層析介質的偶聯制備方法，其特征在于：其方法包括，

使用雙環氧化合物1，4-丁二醇二縮水甘油醚對含有羥基的瓊脂糖進行活化，得到含一長親水鏈的活化環氧瓊脂糖；

所述活化環氧瓊脂糖上的環氧乙烷基團與IN*片段C端Cys的巰基反應，將親和配基片段 IN*與活化后的瓊脂糖介質進行偶聯得到親和層析介質。

8.一種利用如權利要求6所述的親和層析介質的應用，其特征在于：包括，

將親和層析介質裝柱；

用含有1mmol/L Zn2+的PBS緩沖液進行平衡；

將含有目的蛋白的IC融合蛋白粗樣進行上樣；

用不含Zn2+的PBS緩沖液進行清洗；

用含有50mmol/L DTT的斷裂緩沖液沖洗層析介質，室溫下靜置3h；

用洗脫緩沖液洗脫斷裂后的目標蛋白并進行收集；

IN*親和層析柱進行再生。