[發明專利]灰略紅鏈霉菌果膠裂解酶編碼基因及其外源表達和應用

在審

• 申請號: 201610729000.4
• 申請日: 2016-08-25
• 公開（公告）號: CN106636046A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 周培;支月娥;馮海瑋;孫玉靜;毛亮;聶文翰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司31236
• 代理人: 封喜彥,胡晶

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種克隆自灰略紅鏈霉菌的果膠裂解酶編碼基因序列、含有該基因序列的表達載體、轉基因表達菌株和重組果膠裂解酶的特殊酶學活性。

背景技術

果膠酶是廣泛存在于果實及多種微生物可以作用于果膠質的一類由許多單酶組成的復合酶的總稱。果膠酶在苧麻脫膠、木材防腐和酒精發酵等領域具有主要的應用意義，目前已廣泛應用于食品行業。

果膠裂解酶是果膠酶的重要組成部分，能催化聚半乳糖醛酸α-1，4鍵的斷裂，是一種能降解植物細胞壁，導致植物組織軟化甚至死亡的解聚酶。果膠裂解酶作用于半乳糖醛酸的第5位β-碳原子，使β-碳原子上的氫原子轉移到糖苷鍵的氧原子上，糖苷鍵斷裂，在半乳糖醛酸的C-4和C-5之間形成雙鍵。果膠裂解酶在果汁澄清、酶法浸解、酶法提取果汁技術方面的應用廣泛，特別是在食品行業中果汁、果酒的澄清及提高水果出汁率等方面具有重要作用。近期研究發現，果膠裂解酶還可以用于植物病毒的純化、紙漿漂白劑紡織品的生物精煉等，為果膠裂解酶在減少環境污染和降低能源消耗方面的研究指明了新方向。自20世紀90年代以來，人們把研究重點從篩選產堿性果膠酶的菌種逐步轉向產果膠裂解酶基因及基因工程上，尤其是隨著新型堿性果膠酶產品的快速發展，人們將注意力越來越多的注意力轉向了酶的提純、基因及其克隆技術的研究。

果膠裂解酶來源廣泛，細菌、真菌和放線菌都已產生果膠裂解酶，但是能產生果膠裂解酶并成功應用于工業生產的實例還很少。研究表明，鏈霉菌是合成果膠裂解酶的理想菌株。本發明針對一種克隆自灰略紅鏈霉菌的新型果膠裂解酶，對其進行原核表達分析及初步酶學性質分析，為該果膠裂解酶的異源重組表達及生產利用提供了有效的途徑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種灰略紅鏈霉菌果膠裂解酶。

本發明的另一目的在于提供上述果膠裂解酶的編碼基因。

本發明的另一目的在于提供含有上述編碼基因的重組表達載體或重組大腸桿菌。

本發明的另一目的在于提供一種上述的果膠裂解酶編碼基因在表達果膠裂解酶中的應用。

本發明的另一目的在于提供一種利用上述轉基因重組大腸桿菌誘導發酵果膠裂解酶的方法。

本發明的目的是通過以上技術方案實現：

一種灰略紅鏈霉菌果膠裂解酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

一種上述灰略紅鏈霉菌果膠裂解酶的編碼基因。

一種含有所述的果膠裂解酶的編碼基因的重組表達載體。

一種含有所述的果膠裂解酶的編碼基因的大腸桿菌重組菌株。

所述的果膠裂解酶及其編碼基因克隆自灰略紅鏈霉菌，所述的果膠裂解酶呈現SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，該果膠裂解酶由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列編碼。

所述的SEQ ID NO.1克隆自灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名為JSD-1，現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.5706，保藏日期為2012年1月9日。

本發明所述的果膠裂解酶基因序列是通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。本發明涉及的實驗技術包括鏈霉菌基因組及大腸桿菌質粒DNA的提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠回收、連接、質粒酶切、轉化、蛋白誘導表達及純化、聚丙烯酰胺凝膠電泳及重組果膠裂解酶活性的測定等。具體步驟為：以灰略紅鏈霉菌基因組為模板，通過PCR擴增獲得該果膠裂解酶編碼基因序列，隨后將該基因序列連接到表達載體pET-22b(+)上并將重組質粒轉化到特定的大腸桿菌表達菌株Transetta(DE3)內，進而獲得果膠裂解酶表達菌株，最終通過IPTG誘導實現果膠裂解酶的體外高效表達。收集菌體細胞破碎，離心后獲得粗酶液后進行蛋白純化并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western Blot檢測表達情況。最后，測定該果膠裂解酶相關的酶學特征。

該果膠裂解酶的編碼基因共有1284個核苷酸，序列如SEQ ID NO.1，共編碼427個氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的重組表達載體為：將所述的果膠裂解酶的編碼基因插入大腸桿菌表達載體，進而得到表達果膠裂解酶的重組表達載體；

所述的大腸桿菌表達載體為pET-22b(+)載體。

所述的大腸桿菌重組菌株為：將含有所述的果膠裂解酶的編碼基因的重組表達載體導入大腸桿菌宿主細胞進而得到轉基因重組菌株；