[發(fā)明專利]固定化賴氨酸脫羧酶、其制備、1,5?戊二胺制備方法及產(chǎn)品

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610728670.4
• 申請日: 2016-08-25
• 公開（公告）號: CN107779447A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐冠珠;于麗珺;劉修才
• 申請（專利權(quán)）人: 上海凱賽生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司;凱賽生物產(chǎn)業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12N11/08;C12N11/02;C12P13/00
• 代理公司: 北京律智知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11438
• 代理人: 王瑩,于寶慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種固定化賴氨酸脫羧酶、其制備方法以及采用所述固定化賴氨酸脫羧酶的1,5-戊二胺制備方法及其制得的1,5-戊二胺。

背景技術(shù)

生物催化反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、反應(yīng)效率高等特點(diǎn)，因而越來越多地應(yīng)用于化學(xué)合成領(lǐng)域。但由于生物酶在體外工業(yè)環(huán)境下的穩(wěn)定性差以及酶制劑的成本過高等缺陷，極大地限制了生物催化在工業(yè)領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用。

固定化酶技術(shù)通過將酶分子束縛(或結(jié)合)于水不溶性載體上，不僅有效解決了催化劑的重復(fù)使用問題，還可顯著改善生物酶的穩(wěn)定性及催化特性(底物親和力、立體選擇性等)。目前，固定化酶研究內(nèi)容廣泛，研究表明：載體的合成、表征、幾何參數(shù)、表面活性及理化性質(zhì)等，對于酶的固載量、酶活回收率和穩(wěn)定性等方面，有很重要的影響。現(xiàn)在，在工業(yè)上已經(jīng)成功固定化并應(yīng)用的酶有青霉素酰化酶、葡萄糖異構(gòu)酶等。

1,5-二氨基戊烷(也稱為1,5-戊二胺，簡稱戊二胺)是化學(xué)工業(yè)中重要的五碳化合物，主要用途是制造聚酰胺、聚氨酯等，另外還可以用來制造異氰酸酯、吡啶、哌啶等重要化工原料。迄今為止，工業(yè)上二胺類物質(zhì)主要由石油基原材料經(jīng)二羧酸中間體或者通過氨基酸的化學(xué)脫羧作用進(jìn)行化學(xué)生產(chǎn)(Albrecht，Klaus等人；Plastics；Winnacker-Kuechler(第5版)(2005))。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人類可以利用生物法合成1,5-戊二胺，主要是通過微生物自身或者外源過量表達(dá)的賴氨酸脫羧酶催化底物賴氨酸脫羧，得到1,5-戊二胺，以下文獻(xiàn)和專利中對此進(jìn)行了描述：Tabor,Herbert,etal；Journal of bacteriology(1980),144(3),952-956，JP2002-223770，JP2008104453A，CN200810005332、JP2002-223771A、JP2004-000114A、EP1482055B1、JP2005-060447A，CN101578256A，CN 102056889A，CN 102782146A等。

目前，生物法的賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸生成1,5-戊二胺的工藝中通常使用游離狀態(tài)的賴氨酸脫羧酶或賴氨酸脫羧酶細(xì)胞，或者使用可同時(shí)生產(chǎn)賴氨酸和賴氨酸脫羧酶的菌株發(fā)酵生產(chǎn)1,5-戊二胺，但是以上1,5-戊二胺生產(chǎn)方式導(dǎo)致酶或細(xì)胞的重復(fù)利用效率低、產(chǎn)物回收困難、生產(chǎn)成本高，不利于1,5-戊二胺的工業(yè)化生產(chǎn)。

在此之后，研究人員采用固定化細(xì)胞的方式生產(chǎn)1,5-戊二胺。日本專利申請JP 2004298033A中描述采用角叉菜膠將產(chǎn)賴氨酸脫羧酶菌株包埋后培養(yǎng)產(chǎn)酶，然后收集培養(yǎng)好的固定化微生物催化賴氨酸鹽生產(chǎn)1,5-戊二胺，246g/l的賴氨酸鹽酸鹽經(jīng)過固定化細(xì)胞150h的催化，生成的1,5-戊二胺濃度為40g/l，賴氨酸鹽酸鹽的摩爾轉(zhuǎn)化率約為30％。

文獻(xiàn)“用固定化L-賴氨酸脫羧酶細(xì)胞制備1,5-戊二胺”(蔣麗麗等，精細(xì)化工，2007，24(11)，1080-1084)中報(bào)道采用3wt％的海藻酸鈣固定含有賴氨酸脫羧酶的細(xì)胞，此固定化細(xì)胞穩(wěn)定性很差，第2批轉(zhuǎn)化時(shí)酶活就發(fā)生顯著下降，到第4批時(shí)酶活降低到約為第1批酶活的38％。

綜合文獻(xiàn)和專利報(bào)道可得出，目前制備的含有賴氨酸脫羧酶活性的固定化細(xì)胞多采用天然高分子凝膠為載體，在實(shí)際操作中存在著強(qiáng)度不高，容易被微生物分解，在轉(zhuǎn)化過程中變形、破碎或者溶解，引起酶或細(xì)胞的滲漏，固定化細(xì)胞重復(fù)使用效率低等問題。因此，本領(lǐng)域需要一種更簡單、經(jīng)濟(jì)、可顯著提高賴氨酸酶法脫羧穩(wěn)定性的方法。

目前，對固定化賴氨酸脫羧酶的制備及穩(wěn)定性研究的報(bào)道較少，且對價(jià)格低廉的載體進(jìn)行化學(xué)改造而使之適用于固定化賴氨酸脫羧酶的制備均未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為克服賴氨酸脫羧酶在生物化工生產(chǎn)領(lǐng)域存在的穩(wěn)定性、重復(fù)使用率等方面的缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種固定化賴氨酸脫羧酶。

本發(fā)明的另一目的是提供一種固定化賴氨酸脫羧酶的制備方法。

本發(fā)明的還一目的是提供一種1,5-戊二胺制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述制備方法制得的1,5-戊二胺。

以下，對上述技術(shù)方案，進(jìn)行詳細(xì)和優(yōu)選說明：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種固定化賴氨酸脫羧酶，所述固定化賴氨酸脫羧酶包括：醛基修飾的高分子載體以及賴氨酸脫羧酶，其中，所述賴氨酸脫羧酶通過與所述醛基修飾的高分子載體上的醛基反應(yīng)，形成共價(jià)鍵固定于所述高分子載體之上。