[發(fā)明專利]猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域及其變體的目的蛋白

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610717621.0
• 申請日: 2016-08-24
• 公開（公告）號: CN106317208B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉紅旗;劉波;李超;陶玉芬;劉建生;李昕潼
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
• 主分類號: C07K14/08
• 分類號: C07K14/08;C12N15/40;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569;A61K39/12;A61P31/14;C12R1/19
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊;蔣文睿

1.猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域的目的蛋白，其特征在于：其核苷酸基因序列如SEQID No.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域的目的蛋白，其特征在于：其氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。

3.猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域變體的目的蛋白，其特征在于：其核苷酸基因序列如SEQ ID No.3所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求上述GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域變體的目的蛋白，其特征在于：其氨基酸基因序列如SEQ ID No.4所示。

5.權(quán)利要求1或2所述猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域的目的蛋白或者權(quán)利要求3或4所述猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域變體的目的蛋白，在制備抗諾如病毒疫苗中的應(yīng)用，或者在制備檢測抗諾如病毒試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

6.猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域及其變體的目的蛋白的制備方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟得到：

（1）將pGEX-4T-1質(zhì)粒用BamH I和Not I進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖核酸膠酶切后進(jìn)行基因回收，得到含GST標(biāo)簽的線性pGEX-4T-1載體質(zhì)粒；

（2）將腹瀉猴子的糞便制成懸液，通過RT-PCR技術(shù)及測序獲得猴源GII.17諾如病毒VP1基因序列，按照大腸桿菌密碼子使用的偏好性優(yōu)化VP1蛋白的核苷酸序列，人工合成VP1基因；以此基因為模板，通過如下P-RGD引物和PΔR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到含RGD序列的P結(jié)構(gòu)域基因和不含精氨酸聚合區(qū)的P結(jié)構(gòu)域變體基因，即帶酶切位點(diǎn)的兩個質(zhì)粒P-RGD、P△R：

P-RGD引物F： tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc

R：1、gcagaagcag tcaccacggc agtcgcactg cgcacgacgg

2、cagtcagtca cgatgcggcc gcttagcaga agcagtcacc ac

PΔR引物F： tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc

R：cagtcagtca cgatgcggcc gcttacccat tcccggtgc

擴(kuò)增后的基因片段純化后通過無縫拼接分別克隆進(jìn)入步驟（1）的含GST標(biāo)簽的線性pGEX-4T-1載體質(zhì)粒，得到兩個原核表達(dá)質(zhì)粒P-RGD-GST和PΔR-GST；

（3）將步驟（2）得到的兩個原核表達(dá)質(zhì)粒P-RGD-GST和PΔR-GST分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有氨芐西林的LB平板并篩選陽性克隆，將陽性克隆進(jìn)行培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送測序驗證；

（4）將步驟（3）測序驗證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過菌落PCR擴(kuò)增，鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功后，即得到P-RGD-GST、PΔR-GST表達(dá)克隆子；

（5）利用IPTG誘導(dǎo)步驟（4）得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表達(dá)克隆子，得到高效表達(dá)的P-RGD-GST、PΔR-GST目的蛋白，用超聲方法對目的蛋白進(jìn)行細(xì)胞壁破碎，經(jīng)離心，分別收集上清和沉淀，用GST親和純化柱對P-RGD-GST、PΔR-GST重組蛋白進(jìn)行純化，用Thrombin酶切掉GST標(biāo)簽，純化后分別得到P-RGD和PΔR目的蛋白；

所述猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域的目的蛋白核苷酸基因序列如權(quán)利要求1的SEQID No.1所示、氨基酸基因序列如權(quán)利要求2的SEQ ID No.2所示；

所述猴源GII.17型諾如病毒P結(jié)構(gòu)域變體的目的蛋白核苷酸基因序列如權(quán)利要求3的SEQ ID No.3所示、氨基酸基因序列如權(quán)利要求4的SEQ ID No.4所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）的人工合成VP1基因是5^，端和3^，端分別含有限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I酶切位點(diǎn)序列。