[發明專利]一種植物內生菌16S rRNA基因擴增方法及應用

有效

• 申請號: 201610716279.2
• 申請日: 2016-08-24
• 公開（公告）號: CN106282165B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 張時恒;孫梓健;安家興;劉馳;涂波
• 申請（專利權）人: 成都羅寧生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 馬冬新

本發明公開了一種植物內生菌16S rRNA基因擴增方法及應用，其擴增步驟包括植物預處理、植物樣本總DNA提取、樣本16S rRNA基因的擴增和基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析，樣本16S rRNA基因的擴增包括16S rRNA基因全長的乳液PCR擴增和16S rRNA基因高變區/保守區擴增子擴增，基于Illumina平臺的高通量測序及生物信息分析包括植物內生細菌16S rRNA基因擴增子純化回收、擴增子測序文庫構建、Illumina HiSeq測序和測序數據生物信息學分析。該基因擴增方法用于高通量測序的植物病害檢測及植食性動物腸道微生物檢測。本發明采用高通量測序技術進行植物內生細菌的測序分析，數據量更大，檢測結果更完整，而且最大程度降低了植物宿主的污染，結果多樣性更高，而且成本低。

技術領域

本發明涉及基因擴增技術領域，具體是一種植物內生菌16S rRNA基因擴增方法及應用。

背景技術

植物內生菌是植物微生態系統中的重要組成部分，在長期協同進化過程中其與植物形成了相互依存的關系。植物內生菌可以產生活性物質作為生物紡織資源、外源基因的載體和新藥的來源，在農業、醫藥衛生領域有著巨大的應用前景。雖然經過多年的研究，但目前植物內生細菌的研究還是處于初級階段，對于植物內生細菌在植物中的分布及豐度調查還依賴于傳統的分離純化后使用通量較低的DGGE等方法，即使采用高通量測序進行的相關研究也因為植物宿主本身的質體和線粒體的干擾，造成植物內生細菌的研究始終處在基礎研究的水平。

發明內容

本發明的目的在于克服植物內生細菌傳統研究方法中需培養分離和植物宿主基因干擾等技術局限，提供一種植物內生菌16S rRNA基因擴增方法及應用，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種植物內生菌16S rRNA基因擴增方法，具體步驟如下：

(1)植物預處理：取植物樣本0.5-1g，經超聲清洗后在超凈臺中使用有效率濃度2％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒4-6min，使用無菌水沖洗一遍后使用體積百分比為70-75％的乙醇溶液浸泡25-35s，隨后使用無菌水沖洗3-5遍徹底去除樣本表面消毒劑；

(2)植物樣本總DNA提取：通過表面消毒的樣本經液氮研磨均勻后轉至1.5ml離心管中，通過CTAB法純化樣本總DNA；

(3)樣本16S rRNA基因的擴增：包括16S rRNA基因全長的乳液PCR擴增和16S rRNA基因高變區/保守區擴增子擴增；

31)16S rRNA基因全長的乳液PCR擴增

①設計三對引物AP1429(F/R)，MTR(F/R)和CHP(F/R)均以原核生物和植物16SrRNA基因為模板，其中MTR(F/R)和CHP(F/R)引物3’末端以C3spacer或C5spacer修飾，下劃線標記堿基為鎖核酸修飾基團，用于抑制植物宿主來源的污染，AP1429(F/R)引物對用于植物內生細菌16S rRNA基因的擴增；

②配置植物內生細菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，該混合液由乳液發生劑和PCR擴增緩沖液構成；

③將步驟②用于擴增植物內生細菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mLPCR管中并置于帶有熱蓋功能的PCR儀中，在PCR以上運行以下反應循環：95℃1min，1個循環；98℃5s，68-70℃1min，55℃30s，68-72℃1min，25個循環；68-72℃5min，1個循環；25℃恒溫；