[發明專利]包載SA?mGM?CSF或/和SA?hTNFα的生物素化殼聚糖?海藻酸鈣微球的制備

在審

• 申請號: 201610715801.5
• 申請日: 2016-08-18
• 公開（公告）號: CN107753934A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 高基民;馬艾靈
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: A61K38/19
• 分類號: A61K38/19;A61K47/36;A61K9/50;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫藥制劑技術領域，主要是包載SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化殼聚糖-海藻酸鈣微球制劑的制備方法。

背景技術

作為威脅人類身心健康的主要殺手之一，惡性腫瘤的病發率和致死率不斷地上升，病患年齡也呈現減小趨勢，一旦確診給患者和家庭乃至社會都會帶來極大痛苦與負擔。惡性腫瘤的死因順位在發達國家人口死亡的原因中排列第一位，在發展中國家中位列第二位^[1]。所以癌癥的研究和診治已成為全球性的衛生事業鉆研的重點。傳統治療手段以手術聯合化療和放射療法的方式進行，雖然有一定的治療效果，但是存在復發率高，對正常組織損傷大，腫瘤治療針對性差和毒副損傷大等很多不足。很多科研工作者正不斷探索和嘗試更多新型治療手段。

腫瘤免疫治療中經常用到各種細胞因子，它能夠廣泛調節各種免疫或非免疫細胞的功能，作用于機體的各種系統，增強免疫應答，更好地殺傷腫瘤。但是細胞因子的應用也存在一定的局限性：由于代謝較快，易受環境和蛋白酶影響，在體內維持的時間很短暫，不能穩定維持病灶的有效濃度，甚至可能產生不同程度的毒副損傷；其劑量水平在免疫治療中起到關鍵作用：劑量過低會產生免疫耐受，劑量過高、大面積彌散會對機體產生免疫損傷或毒副作用。新型給藥體系的研發具有重要意義，是當下研究的熱點。

海藻酸鈉是一種天然的親水性線性多糖，經FDA認證為一種安全的化合物，當海藻酸鈉分子接觸二價陽離子如Ca²⁺、Ba²⁺時可以很快形成囊狀結構。包載蛋白的海藻酸鈉凝膠可以維持蛋白較高的活性，同時調節其中蛋白類藥物的緩慢釋放。殼聚糖由于具有易于成膜、生物相容性好、可生物降解、產物無毒無害等特性，廣泛應用于醫藥、化工、食品和環保等不同領域。殼聚糖的氨基可以進行生物素化修飾，也可以與海藻酸鈉的羧基發生反應，制備出的海藻酸鹽-殼聚糖復合微球。這種復合微球體系可以保護藥物免受環境和蛋白酶的影響，滿足治療劑量的同時可以防止短時間濃度過高、彌散造成的損傷。此時，藥物的吸收、利用和分布主要取決于載體材料性質，而不是藥物本身的性質。海藻酸鹽-殼聚糖復合微球還具有維持藥物活性、控制藥物緩慢釋放、延長作用時間和增強靶向性等特性。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte and macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是免疫治療中較為常用到的一種細胞因子，它可以調節單核、巨噬、造血和嗜中性、酸性粒細胞等多種細胞的生成，并影響其生命周期進程，同時有利于成熟細胞釋放到外周血液中，可以提高DC抗原提呈能力，協調CD4⁺、CD8⁺T細胞的功能，和抗體參與的免疫反應。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)對正常組織無害，對腫瘤細胞卻可以直接殺傷并且抑制其增殖、生長，TNFα在體內可以使腫瘤細胞逐漸出血壞死，瘤體積逐漸減小甚至消失。

本發明中選擇SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα(m代表小鼠，h則代表人)為實驗藥物，制備了包載SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化殼聚糖-海藻酸鈣微球；同時引入了生物素-親和素反應系統-一分子的親和素可以強力結合四分子的生物素，借助鏈霉親合素(Streptavidin，SA)將微球錨定在腫瘤細胞膜表面，通過持續在病灶局部釋放所包載SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種制備包載SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化殼聚糖-海藻酸鈣微球的方法，保證制備出的微球表征指標良好，且制備過程能保持各細胞因子的生物學活性。為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

1.空載海藻酸鈣微球的制備。進行四因素三水平正交試驗確定空載海藻酸鈣微球制備的最佳配方。

2.包載蛋白的海藻酸鈣微球的制備。向海藻酸鈉溶液中加入不同質量的SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα進行載蛋白海藻酸鈣微球的制備，通過比較包封率和載藥量確定兩種蛋白的最佳投放量。

3.包載蛋白的生物素化殼聚糖-海藻酸鈣微球的制備。將最佳投放量的SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα分散到海藻酸鈉溶液中，同時將生物素化殼聚糖溶液分散到CaCl₂溶液中，分別制備成w/o型乳液，然后混合，交聯固化得到生物素化殼聚糖-海藻酸鈣微球。

附圖說明