[發明專利]一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶及其編碼基因和應用

在審

• 申請號: 201610711425.2
• 申請日: 2016-08-23
• 公開（公告）號: CN106636035A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 周培;支月娥;馮海瑋;孫玉靜;毛亮;羅艷青;聶文翰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司31236
• 代理人: 胡晶

技術領域

本發明涉及基因工程和現代酶工程技術領域，涉及一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶及其編碼基因和應用，具體涉及一種果膠酯酶及其編碼基因序列、含有該編碼基因序列的重組表達載體和轉基因重組菌以及該果膠酯酶的應用。

背景技術

果膠酶是廣泛存在于果實及多種微生物中，是一類可以作用于果膠質的一類由許多單酶組成的復合酶的總稱。果膠酶在苧麻脫膠、木材防腐和酒精發酵等領域具有主要的應用意義，目前已廣泛應用于食品行業。

果膠酯酶(EC 3.1.1.11)是一種能催化、水解果膠生產果膠酸和甲醇的酶。果膠酶對聚半乳糖醛酸甲酯具有高度的專一性，無法催化聚甘露糖醛酸甲酯，但是能夠水解聚半乳糖醛酸乙酯、丙酯和烯丙酯，但是水解速度較甲酯低。果膠酯酶能夠從果膠分子的還原性末端或其臨近的游離羧基開始進攻去甲氧基，沿著分子以單鏈機制進行，形成對二價陽離子非常敏感的游離態半乳糖醛酸區域。目前，果膠酯酶在食品行業中應用較多，常用于制備低甲氧基果膠及果汁澄清加工。因此，果膠酯酶有著廣泛的用途和開發前景，目前新型果膠酯酶的開發和制備已經成為研究的熱點。

果膠酯酶來源廣泛，細菌、真菌和放線菌都能產生果膠酯酶，但是能產生果膠酯酶并成功應用于工業生產的實例卻還很少。研究表明，鏈霉菌是合成果膠酯酶的理想菌株。本發明針對克隆自灰略紅鏈霉菌的新型果膠酯酶，經密碼子優化后對其進行原核表達分析及初步酶學性質分析，為該果膠酯酶的異源重組表達及生產利用提供了有效的途徑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶。

本發明的另一目的在于提供一種果膠酯酶的編碼基因。

本發明的另一目的在于提供一種含有上述的果膠酯酶編碼基因的重組表達載體或轉基因重組菌。

本發明的另一目的在于提供一種上述的果膠酯酶編碼基因在表達果膠酯酶中的應用。

本發明的另一目的在于提供一種上述的果膠酯酶在水解果膠中的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案實現：

一種灰略紅鏈霉菌果膠酯酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO.3。

本發明提供的果膠酯酶及其編碼基因克隆自灰略紅鏈霉菌(Streptomyces griseorubens)，命名為JSD-1，現保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號,保藏日期：2012.01.09，保藏編號為CGMCC No.5706，具有下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

(2)所述的核苷酸序列SEQ ID NO.1經密碼子優化后得到的SEQ ID NO.2的核苷酸序列；

(3)編碼序列表中的SEQ ID NO.3氨基酸序列的多核苷酸。

本發明所述的果膠酯酶基因序列是通過全基因組測序、密碼子優化及全基因人工合成的方式獲得。本發明涉及的實驗技術包括灰略紅鏈霉菌基因組及大腸桿菌質粒DNA的提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠回收、連接、質粒酶切、轉化、蛋白誘導表達及純化、聚丙烯酰胺凝膠電泳及重組果膠酯酶活性的測定等，具體步驟為：以灰略紅鏈霉菌基因組為模板，通過密碼子優化及基因人工合成的方式獲得該基因序列，隨后將該基因序列連接到表達載體pET-22b(+)上，并將重組質粒轉入到特定的大腸桿菌表達菌株TransB(DE3)內，進而獲得果膠酯酶表達菌株，最終通過IPTG誘導實現果膠酯酶的體外高效表達，最后收集菌體、細胞破碎，離心后獲得粗酶液，之后進行蛋白純化并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western Blot檢測表達情況，最后測定該果膠酯酶相關的酶學特征。

從灰略紅鏈霉菌得到的果膠酯酶具有以下特征：

1.該果膠酯酶的編碼基因共有1101個核苷酸，序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，共編碼366個氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

2.該果膠酯酶的適合反應溫度為45～65℃，優選為55℃。

3.該果膠酯酶的適合反應的pH為7～10，優選為8。