[發明專利]一種二肽酶突變體及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201610705142.7
• 申請日: 2016-08-22
• 公開（公告）號: CN106318928B
• 公開（公告）日: 2020-01-07
• 發明（設計）人: 龍麗娟;楊鍵;肖運柱;田新朋;李潔;張偲
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/57;A62D3/02;A62D101/28;A62D101/04;A62D101/26
• 代理公司: 44001 廣州科粵專利商標代理有限公司
• 代理人: 劉明星

本發明公開了一種二肽酶突變體及其編碼基因和應用。本發明以一種具有水解有機磷化合物混雜活性的海洋細菌二肽酶OPAA4301（其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）為蛋白質工程改造起點，運用定點飽和突變和組合突變技術改造其底物結合位點，獲得有機磷化合物水解活性提高的二肽酶突變體D45W/H226G。突變體D45W/H226G水解對氧磷的催化速率相較于野生型獲得顯著提高。本發明的二肽酶突變體可高效水解對氧磷等常見有機磷化合物污染物，在有機污染修復領域具有良好應用前景。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種二肽酶突變體及其編碼基因和應用。

背景技術：

有機磷化合物屬于磷酸酯或磷酸硫醇類衍生物。世界首例有機磷化合物四乙基焦磷酸酯于1937年被人工合成，二戰期間沙林、索曼等有機磷化合物曾被用作化學武器，而在現代有機磷被作為農藥、石油添加劑、增塑劑、阻燃劑等在工農業中廣泛使用。以農藥為例，目前有機磷類農藥有100余種，占世界農藥總使用量的38％。我國是農藥生產和使用大國，2015年化學農藥原藥年產量達374萬噸，其中有機磷農藥占近一半，我國有機磷類農藥使用量約每年8萬噸。有機磷化合物能與乙酰膽堿酯酶等受體蛋白絲氨酸特異結合，對高等動物具有強神經毒性。人類活動持續過度使用的有機磷化合物經地表徑流和土壤滲漏進入江河，最終匯入海洋，可顯著影響微藻、甲殼類動物、棘皮動物和魚類的生長發育。有機磷污染已成為全球性環境問題，有機磷化合物殘留在土壤、河流、江河入海口、近岸海洋等區域被廣泛檢測到，并對人類健康造成威脅，據估計每年有近300萬起因攝入有機磷化合物引發的中毒事件。

微生物徹底礦化有機磷化合物轉變為能量需經歷水解、氧化等多步反應，其中對磷氧烷基或磷氧芳基酯鍵的水解是有機磷化合物解毒最為關鍵的一步，而此步反應由微生物體內的有機磷水解酶催化。有機磷水解酶，亦稱磷酸三酯酶(EC 3.1.8)，該類酶包含兩個亞類：一是芳二烷基磷酸酯酶(EC 3.1.8.1)，傾向水解含P-O的有機磷酸三酯類化合物；另一類是二異丙基氟磷酸水解酶(EC 3.1.8.2)，傾向水解含P-F或P-CN鍵的有機磷酸酯類化合物。目前研究較多的微生物有機磷水解酶主要包括三類：有機磷水解酶(organophosphorus hydrolase，OPH)、甲基對硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase，MPH)和有機磷酸酐酶(organophosphorous acid anhydrolase，OPAA)。OPH，MPH和OPAA在結構上無相似性，但都是二價金屬酶，依靠金屬離子去質子化水分子實現對磷酸酯鍵的攻擊。有機磷水解酶降解有機磷類異型生物質的活性均來自具有其他功能的常見蛋白結構域。OPH屬于氨基水解酶超家族，具有典型的(α/β)8桶結構；MPH屬于β-內酰胺酶超家族，能高效水解甲基對硫磷，該類酶僅在中國發現；OPAA來源于肽酶M24B家族，該家族蛋白羧基端都由保守的皮塔餅結構構成。OPH和MPH都能水解信號分子高絲氨酸內酯，內酯酶活性是對氧磷酶活性的10²-10⁶倍，提示這兩類有機磷水解酶由細菌群感效應調節蛋白進化而來。已鑒定的OPAA一級結構與脯氨酸二肽酶高度同源，這類肽酶在細菌體內參與膠原蛋白利用過程，介導脯氨酸的釋放，為微生物體提供營養，而有機磷水解酶是其混雜活性，通常對含有P＝S鍵的有機磷類化合物催化活力極微弱，利用蛋白質工程技術改良這類肽酶可增強該酶水解有機磷化合物的能力，使其成為有機磷類污染物修復工具酶源。

發明內容：

本發明針對現有技術中二肽酶OPAA4301對有機磷化合物水解活力較弱的不足，提供了一類水解有機磷化合物活性提高的二肽酶突變體及其編碼基因和應用。