[發明專利]嚴重聯合免疫缺陷動物模型的構建以及應用

在審

• 申請號: 201610667884.5
• 申請日: 2016-08-15
• 公開（公告）號: CN107760720A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 張海;師長宏;彭思穎;李紅伍;張鑫淼
• 申請（專利權）人: 北京艾德摩生物技術有限公司;中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所11105
• 代理人: 張文輝,易方方

技術領域

本發明涉及一種嚴重聯合免疫缺陷動物模型的構建方法以及應用。

背景技術

建立免疫缺陷的動物模型普遍用于治療腫瘤藥物的篩選、癌癥的治療方法等試驗。利用免疫缺陷的動物模型對研究腫瘤藥物、以及其它疾病的治療機理有著極大的作用，從而可以實現對疾病的治療和預防控制，從而提高治愈率。

1966年研究者發現Foxn1基因突變后小鼠T細胞功能障礙，不能產生細胞特異性免疫反應，由此開辟了自發性免疫缺陷動物研究的先河。隨之B細胞缺陷的Beige小鼠、T細胞及B細胞聯合缺陷SCID小鼠也相繼被發現并在生物醫學研究的多個領域得到廣泛應用。盡管T細胞和/或B細胞功能障礙后形成的免疫缺陷小鼠在生物醫學研究中取得了很多重大的研究成果，但其體內殘存的NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等介導的先天性免疫應答反應仍然會對移植物產生免疫排斥反應，從而影響腫瘤在其體內存活。近年來，研究者進行了許多努力，試圖找到免疫缺陷程度更高、免疫包容性更強的實驗用小鼠以替代裸鼠或SCID小鼠。

BALB/c小鼠由于其生物學特性明確，是目前免疫學、微生物學等研究領域常用的近交系小鼠。nude基因導入BALB/c小鼠后可培育成傳統的免疫缺陷小鼠品系BALB/c-nu/nu，該類小鼠T細胞缺陷，因而T細胞介導的細胞免疫功能嚴重下降[6]。但該類小鼠B細胞及其他免疫細胞正常，這些細胞介導的免疫反應常會影響動物模型復制效果。如人類腫瘤模型復制時，一些人類腫瘤模型難以在BALB/c-nu/nu裸鼠中建立，除腫瘤細胞致瘤性外，BALB/c-nu/nu裸鼠免疫細胞狀態也是影響腫瘤模型復制的關鍵因素之一。為了克服以上弊端，有必要研究出免疫缺陷程度更高、免疫包容性更強、且遺傳背景來源于BALB/c小鼠的動物用于免疫學、微生物學、腫瘤學等領域研究。

基于此目的，本發明研究制備出了一種免疫缺陷程度更高的動物模型，有利于各種疾病模型的構建，并進一步利于治療藥物的篩選。

發明內容

為了解決現有技術中建立免疫缺陷小鼠品系周期長、品系不純的技術缺陷，以及沖破美國、日本對我國的技術封鎖。本發明研究制備了一種免疫缺陷程度更高、免疫包容性更強的動物模型的構建方法以及應用，從而能夠實現各種疾病模型的制備，進一步利于治療或預防藥物的篩選。

本發明一方面涉及一種嚴重聯合免疫缺陷的動物模型的構建方法，該方法涉及對動物T、B細胞的Rag2基因及參與編碼細胞因子受體的Il2rg基因的靶向敲除。

本發明第一方面任一項所述的方法，其中所述的靶向敲除是通過CRISPR/Cas9技術進行動物T、B細胞的Rag2基因及參與編碼細胞因子受體的Il2rg基因的靶向敲除。

本發明第一方面任一項所述的方法，其中所述的靶向敲除涉及針對Il2rg基因和Rag2基因設計并合成sgRNA。

本發明第一方面任一項所述的方法，其中針對Il2rg基因和Rag2基因的sgRNA分別是針對IL2rg基因第1外顯子和Rag2基因第2外顯子。

本發明第一方面任一項所述的方法，其中所述sgRNA的結構具體如表1中所示。

本發明第一方面任一項所述的方法，其中所述的動物為小鼠。

本發明第二方面涉及針對Il2rg和Rag2基因的sgRNA在制備嚴重聯合免疫缺陷動物模型中的應用。

本發明第二方面任一項所述的應用，其中所述針對Il2rg基因和Rag2基因的sgRNA分別是針對Il2rg基因第1外顯子和Rag2基因第2外顯子。

本發明第二方面任一項所述的應用，其中所述sgRNA的結構具體如表1中所示。

本發明第二方面任一項所述的應用，其中所述的動物為小鼠。

本發明第三方面涉及一種構建嚴重聯合免疫缺陷小鼠的方法，包括以下步驟：

(1)寡核苷酸合成及質粒構建；

(2)體外轉錄；

(3)mRNA顯微注射及受精卵細胞移植；

(4)基因敲除小鼠品系建立以及基因型與表型的鑒定。

本發明第三方面任一項所述的方法，其中步驟(1)中的寡核苷酸合成是針對Il2rg基因第1外顯子和Rag2基因第2外顯子設計并合成sgRNA。

本發明第三方面任一項所述的方法，其中針對Il2rg和Rag2基因的sgRNA結構具體如表1中所示。

本發明第三方面任一項所述的方法，步驟(1)中的sgRNA合成后經退火，連入pX330載體，構建含有sgRNA的pX330質粒。