[發(fā)明專利]一種循環(huán)腫瘤DNA肺癌驅(qū)動(dòng)基因的高通量檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610661854.3
• 申請(qǐng)日: 2016-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN107723351A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張道允;鞏子英;葉建偉;王偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 嘉興允英醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種循環(huán)腫瘤DNA中驅(qū)動(dòng)基因的高通量檢測(cè)方法，尤其涉及一種肺癌基因突變情況的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率居各癌癥之首。每年全世界有超過130萬的患者死于肺癌，近一半發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。據(jù)2010年我國(guó)衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)，肺癌死亡率為30.83/10萬，肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率和死亡率第一位的惡性腫瘤。肺癌從組織病理學(xué)上可以分為小細(xì)胞癌（SCLC）和非小細(xì)胞癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩大類，其中非小細(xì)胞癌約占肺癌重病例的85%。在我國(guó)肺癌患者5年的生存率僅為13%，其部分原因是目前化療仍是肺癌主要治療手段，然而多數(shù)化療會(huì)產(chǎn)生較大的毒副作用，不同患者間的化療效果會(huì)有較大差異。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，肺癌的分子靶向治療因其特異性高，毒副作用小，日益成為臨床醫(yī)生首選治療方式。然后，由于缺乏高靈敏度的基因突變檢測(cè)和確診技術(shù)，大多數(shù)肺癌患者無法利用之相匹配的精準(zhǔn)治療方案，從而使患者錯(cuò)失了治療的最優(yōu)方案。

在肺癌中常見的突變基因有EGFR、KARS、ALK、ROS1、MET、HER2、BRAF、RET、NRAS、HRAS、DDR2、NTRK1、FGFR3、RICTOR、AKT1、MEK1、PIK3CA、PTEN、FGFR1、BIM、MAPK1、PDGFRA、TP53等。EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是膜受體酪氨酸激酶家族成員之一，當(dāng)EGFR被配體激活，形成二聚體而激活酪氨酸激酶，引起細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)，調(diào)節(jié)相關(guān)重要基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、遷移、分化以及凋亡。EGFR下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有：Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路，PI3K/PDK1/Akt通路等。在中國(guó)非小細(xì)胞肺癌中，EGFR的突變概率超過35%。因此，針對(duì)EGFR及其信號(hào)通路的靶標(biāo)檢測(cè)和靶向藥物治療已成為腫瘤個(gè)體化診療的重要手段。RAS相關(guān)的蛋白質(zhì)家族是在所有的細(xì)胞和器官中普遍性表達(dá)。當(dāng)ras基因發(fā)生突變后，可產(chǎn)生永久性激活的Ras蛋白。最終導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)性生長(zhǎng)并阻止凋亡，進(jìn)而產(chǎn)生癌變。RAS基因（K-ras，H-ras和N-ras）是人類癌癥中最常見的癌基因；永久激活Ras蛋白被發(fā)現(xiàn)，在人類腫瘤中，20%至25% ras基因發(fā)生了突變。因此，只有K-ras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑治療。研究表明，許多腫瘤病人在其腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中均有c-met過度表達(dá)和基因擴(kuò)增，發(fā)生的概率為2-4%。c-met基因擴(kuò)增能活化EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的ERBB3/PI3K/AKT信號(hào)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)，抑制其凋亡，引發(fā)腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs類藥物的耐藥性，是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）對(duì)吉非替尼、厄洛替尼等分子靶向藥物產(chǎn)生激發(fā)耐藥的重要機(jī)制之一。ROS1（C-Ros Oncogene 1，Receptor Trosine Kinase）與SLC34A2、CD74等基因發(fā)生融合后，會(huì)持續(xù)激活ROS1酪氨酸激酶區(qū)及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信號(hào)通路，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生。ROS1的基因重排在多種惡性腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中的概率約為1%。EML4-ALK融合基因是非小細(xì)胞肺癌中新發(fā)現(xiàn)的分子靶向之一，在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)生的概率為3-7%。所有的EML4-ALK融合基因均有生物學(xué)活性，其嵌合產(chǎn)物可導(dǎo)致ALK酪氨酸激酶持續(xù)高表達(dá)，從而激活下游PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。EML4-ALK融合基因存在與否與ALK激酶抑制劑的療效相關(guān)，小分子酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼對(duì)含有EML4-ALK融合基因突變的肺癌患者療效顯著。目前，靶向治療方案越來越多，相應(yīng)的靶向位點(diǎn)也在增加。因此，癌癥基因突變檢測(cè)對(duì)于癌癥的個(gè)體化治療具有重要的意義。目前常用的基因突變檢測(cè)有測(cè)序法、PCR-SSCP、ARMS、數(shù)字PCR以及第二代高通量測(cè)序技術(shù)（NGS）等。其中測(cè)序法、PCR-SSCP、ARMS、數(shù)字PCR癌癥基因檢測(cè)技術(shù)，都只能提供幾個(gè)基因的少數(shù)位點(diǎn)的突變信息。而利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)，可以一次檢測(cè)全部所需基因，獲取基因全部的突變信息，有助于醫(yī)生更準(zhǔn)確制定治療方案。