[發明專利]用于檢測C?KIT基因1737?1738位突變的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201610654357.0
• 申請日: 2016-08-11
• 公開（公告）號: CN107723360A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 莫敏俐;丁鳳;陳釗;李暉
• 申請（專利權）人: 嘉興雅康博醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種用于檢測C-KIT基因突變的引物、探針及相關試劑盒。

背景技術

C-KIT是一種原癌基因，位于染色體4q11-12，全長約80kb。C-KIT編碼的C-KIT蛋白屬于III型受體酪氨酸激酶家族成員，它是分子量約為145KD的跨膜蛋白，包含了胞內的酪氨酸激酶區、跨膜區和配體結合位點胞外區。當配體與其結合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通過一系列反應激活下游信號轉導通路，從而調節細胞的生長與增殖。

胃腸道間質瘤(GIST)是消化道最常見的間葉源性腫瘤。研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突變率約為90％。

目前Sanger測序法是C-KIT基因突變檢測的主要方法。然而，該方法的靈敏度低，會導致漏檢及假陰性的發生，而且檢測時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。臨床上迫切需要開發一種高靈敏度、快速的C-KIT基因突變檢測技術。

本發明的發明人在胃腸道間質瘤(GIST)的日常檢測中發現了與胃腸道間質瘤有關的位于C-KIT基因的新突變位點，即1737-1738位插入突變。本發明的發明人針對該突變開發了一種快速、高靈敏、操作簡便的檢測試劑盒及相關的檢測方法，可以用于GIST化療預后。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測C-KIT基因突變的引物和探針，所述突變是1737-1738位插入24個堿基ACCCCAACACAACTTCCTTATGAT，對應的氨基酸序列579-580位插入TPTQLPYD(堿基突變：1737_1738ins24，蛋白突變：D579_H580insTPTQLPYD)。本發明的引物與探針包括如下序列：

正向引物(F)：CCCAACACAACTTCCTTATGATAC(SEQ ID No：1)

反向引物(R)：AAGTCACTGTTATGTGTACCCAA(SEQ ID No：2)

探針(PB)：CATGGAAAGCCCCTGTTTCATACTGACC(SEQ ID No：3)

本發明另一方面提供一種用于檢測C-KIT基因1737-1738位突變的檢測試劑盒，所述試劑盒包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示的引物和SEQ ID No.3所示的探針。

根據所采用的PCR方法，本發明的試劑盒還可以包括內參基因和內控基因。

本發明另一方面提供一種檢測C-KIT基因1737-1738位突變的方法，其包括以下步驟：

(1)提取樣本中的基因組DNA，檢測樣本包括新鮮病理組織、石蠟包埋組織、全血和血漿等；

(2)用本發明的試劑盒對DNA進行擴增；

(3)根據熒光PCR儀顯示的Ct值判斷檢測結果：檢測反應體系的FAM熒光強度，以FAM達到設定的閾值時所需要的循環次數Ct值作為陰性、陽性判定標準，Ct值＞38或無擴增為陰性，Ct值≤38為陽性。

本發明采用了特異性引物和探針技術，可以特異性檢測C-KIT基因突變。此方法靈敏度高、特異性強、檢測速度快。

附圖說明

圖1為檢測陰性樣本(野生型)的PCR圖。

圖2為檢測突變陽性樣本的PCR圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，對本發明進一步闡述。應理解，這些實施例僅用于本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照本領域技術人員熟知的常規條件，或者按照制造廠商建議的條件。

一.原理

本發明的特異性引物與探針同DNA模板結合后，Taq DNA聚合酶以脫氧核苷酸(dNTP)為底物，對內參基因(Internal Reference，IR)及C-KIT基因突變型基因進行體外擴增。檢測采用熒光PCR技術，通過特異性探針水解釋放熒光，監測PCR反應的進行，確定C-KIT基因突變情況。

本發明的試劑盒單獨設置了內參基因檢測體系。內參基因是區別于待檢C-KIT基因的管家基因。通過檢測內參基因的擴增情況(FAM通道)，可分析待檢DNA是否能被正常擴增，從而排除DNA純度、濃度不佳，或者含有PCR抑制劑等造成PCR檢測失敗的情況。