[發(fā)明專利]一種寨卡病毒人源單克隆抗體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610649447.0
• 申請日: 2016-08-10
• 公開（公告）號: CN106279409B
• 公開（公告）日: 2019-11-26
• 發(fā)明（設計）人: 高福;嚴景華;王奇慧;仝舟
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;C12N15/85;C12N5/10;A61K39/395;A61P31/14
• 代理公司: 23211 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司
• 代理人: 耿曉岳<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發(fā)明公開了一種寨卡病毒人源單克隆抗體及其應用，屬于醫(yī)藥技術領域。本發(fā)明以大腸桿菌表達的寨卡E蛋白作為抗原，通過流式分選，從一例康復期寨卡患者的PBMCs中篩選到可以特異結合寨卡E蛋白的記憶B細胞，然后對篩選的單一B細胞進行RT?PCR，獲得抗體的可變區(qū)序列與片段，并進一步與恒定區(qū)連接至表達載體中。經哺乳動物細胞表達、純化后，進行一系列的功能檢測，包括與ZIKE?E蛋白的結合力，體外中和效果，體內保護能力等檢測，獲得了3株具有完全保護寨卡病毒感染的人源單克隆抗體。

技術領域

本發(fā)明涉及一種寨卡病毒人源單克隆抗體及其應用，屬于醫(yī)藥技術領域。

背景技術

越來越多的證據表明寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)可引起新生兒小頭癥以及神經發(fā)育異常，如“格林-巴氏綜合征”等。ZIKV，屬于黃病毒，主要由蚊蟲叮咬傳播，但是血液傳播，性傳播以及母胎傳播途徑也有報道。1947年，人們首次在烏干達叢林的獼猴分離到ZIKV。該病毒主要流行于非洲以及亞洲的熱帶地區(qū)。2015年，巴西暴發(fā)寨卡疫情，隨著人群流動擴散至其他國家。目前此次疫情已導致超過60個國家或地區(qū)超過80,000例感染病例。然而，針對該病毒仍缺乏有效的疫苗及治療手段。

中和抗體特異性高、能阻斷病毒的入侵，是治療病毒感染的有效手段。黃病毒囊膜蛋白E蛋白介導病毒與宿主細胞的結合和入侵，是病毒最主要的保護性抗原。X-射線晶體學結構顯示黃病毒E蛋白有三個結構域：DI，DII和DIII。一般認為DIII負責介導病毒與受體的結合，之前的研究結果表明大多數有效的中和抗體都是識別DIII的中和表位。然而，近期的數據顯示病毒表面的E蛋白二聚體以及與相鄰二聚體中也存在高中和表位。DII頭部(98-110位氨基酸)包含一個高度保守的融合區(qū)(fusion loop，FL)，在病毒入侵的膜融合過程中起關鍵作用。不同黃病毒FL區(qū)域保守性非常高，在病毒感染過程中，免疫細胞會產生大量的針對FL的抗體。

已有研究發(fā)現有一些登革等黃病毒的中和抗體具有廣譜中和活性，可以中和寨卡病毒，如：2A10G6、A11、C8等，這些抗體一般結合在保守的融合肽上或附近的區(qū)域。最近有報道從寨卡康復病人PBMC中分離到結合在E蛋白DIII的中和抗體。也有利用小鼠雜交瘤細胞，篩選到能夠結合DIII的寨卡特異性中和抗體。這些抗體不同程度地能夠保護小鼠免受致死劑量的病毒攻擊。然而，RNA病毒在抗體壓力下，具有高突變的特性，盡管已經有些中和抗體被鑒定，但是更多的針對不同表位的新的抗體對于治療是必不可少的。本發(fā)明的目的是鑒定特異的具有保護作用的新的ZIKV中和抗體。

發(fā)明內容

為了解決上述問題，本發(fā)明首先以大腸桿菌表達的ZIKV-E蛋白作為抗原，通過流式分選，從一例康復期ZIKV患者的PBMCs中篩選到可以特異結合ZIKV-E蛋白的記憶B細胞，然后對篩選的單一B細胞進行RT-PCR，獲得抗體的可變區(qū)序列與片段，并進一步與恒定區(qū)連接至表達載體中。經哺乳動物細胞表達、純化后，進行一系列的功能檢測，包括與ZIKE-E蛋白的結合力，體外中和效果，體內保護能力等檢測，獲得了3株具有完全或部分保護寨卡病毒感染的人源單克隆抗體。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種抗體，所述抗體命名為Z3L1、Z20或者Z23；其中Z3L1的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:1且輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:2，Z20的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:3且輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:4，Z23的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO:5且輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:6。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Z3L1的重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO:7、輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO:8。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Z20的重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO:9、輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO:10。