[發明專利]雌二醇快速時間分辨免疫層析定量檢測試紙條

在審

• 申請號: 201610633609.1
• 申請日: 2016-07-26
• 公開（公告）號: CN107656075A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 陸奕娜;陳林;林文;陶偉正;周廣彪;黃學泓;李冠斯
• 申請（專利權）人: 陸奕娜
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/577;G01N33/558;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.雌二醇快速時間分辨免疫層析定量檢測試紙條，其特征在于：包括Fusion5膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜以及吸水紙三部分，PVDF膜位于中間，Fusion5膜與吸水紙分別搭接于PVDF膜左右兩端，Fusion5膜上有加樣區和微球區，微球區上有雌二醇單克隆抗體時間分辨免疫熒光微球和IgG時間分辨免疫熒光微球；PVDF膜上有檢測線和質控線，檢測線上包被雌二醇抗原，質控線上包被抗鼠IgG抗體，試紙底部設有塑料底板。

2.根據權利要求1的試紙條，其制備步驟如下：

(1)質控微球制備：用IgG包被熒光微球；

(2)檢測微球制備：雌二醇單抗包被熒光微球；

(3)空白大卡粘貼：將PVDF膜粘貼在塑料底板中間，Fusion5膜與吸水紙分別搭接于PVDF膜左右兩端；

(4)噴膜：將兔抗標記蛋白的熒光微球和雌二醇單抗的熒光微球采用緩沖液混合稀釋到一定濃度噴到Fusion5膜微球區；雌二醇抗原和抗鼠抗體稀釋后分別噴到PVDF膜的T線和C線位置；

(5)干燥及切條：將上述噴好試劑的大卡烘干、切條。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征還在于步驟(2)雌二醇單抗熒光微球制備步驟如下：

(1)雌二醇半抗原的制備。

(2)雌二醇完全抗原的制備。

(3)將上述雌二醇完全抗原免疫大鼠，得到雌二醇單抗。

(4)微球包被雌二醇單克隆抗體。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征還在于所述的步驟(1)：稱取10-15mg雌二醇溶于0.5-2mL DMSO中，加入0.2-1mg無水碳酸鉀和0.2-1mg 4-溴化丁酸酯類化合物，于50-80℃下攪拌反應，2-4h后加入預冷的蒸餾水，用0.5-2mL乙酸乙酯萃取，蒸餾水洗滌，無水NaSO₄進行干燥，用于氮吹儀上吹干。1mL甲醇溶解產物，加入0.5mL2-4mol/L NaOH溶液水解，待水解完全后滴加2-6mol/L HCl溶液，調pH至3.5，再次使用乙酸乙酯進行萃取沉淀，然后重復上述洗滌、干燥、氮吹步驟2-4次。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征還在于所述的4-溴化丁酸酯類化合物為2、3位碳取代分別為甲基、甲氧基或全為甲基或甲氧基的1-8個碳鏈結構的酯類，所得半抗原的連接臂為一類醚化合物。

6.如權利要求3所述的制備方法，其特征還在于所述的步驟(2)：將雌二醇半抗原采用活潑酯法分別與多肽A、多肽B偶聯制備完全抗原，所用多肽A分子量為1000-5000，不少于8個羧基的鏈式多肽，多肽B分子量為10000-20000，不少于16個羧基的鏈式多肽，分別針對3號和6號位點得到A1：E2-3-MCPE-A，A2：E2-6-MCPE-A，B1：E2-3-MCPE-B，B2：E2-6-MCPE-B四種抗原。

7.如權利要求3所述的制備方法，其特征還在于所述的步驟(3)：將雌二醇完全抗原B1、B2分別加入佐劑混勻后經背部及雙后趾皮下多位點注射大鼠，免疫劑量為50-200μg/只，所得雌二醇單抗C3D2和G6B7。

8.如權利要求3所述的制備方法，其特征還在于所述的步驟(4)所述的單抗C3D2，G6B7分別連接微球或混合連接微球，C3D2∶G6B7＝(50-5)∶1。

9.如權利要求2所述的制備方法，其特征還在于步驟(4)稀釋后檢測微球終濃度為0.4-2mg/mL，質控微球終濃度為0.04-0.1mg/mL；T線抗原終濃度0.2-2mg/mL，C線抗鼠IgG抗體終濃度0.2-2mg/mL；C、T線噴膜液量為0.5-15μL/cm，微球噴膜液量為0.5-15μL/cm。