[發明專利]檢測毒死蜱的酶聯免疫試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201610631416.2
• 申請日: 2016-08-04
• 公開（公告）號: CN106324240B
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 萬宇平;何方洋;朱亮亮;賈芳芳;羅曉琴;崔海峰;馮才偉;楊昌松;馮月君;徐念琴
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測毒死蜱的酶聯免疫試劑盒，其特別適于蔬菜、水果和茶葉中毒死蜱含量的檢測。

背景技術

毒死蜱(Chlorpyrifos)，化學名稱O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，商品名為毒死蜱、樂斯本、白蟻清等，是甲胺磷和甲基對硫磷等高效農藥的新型高效、低毒替代品種，屬于廣譜型有機磷酸酯類殺蟲劑，可用于糧食、蔬菜、水果及經濟作物的害蟲防治。毒死蜱是農產品與食品中農藥殘留監測的重要目標物之一，不僅在農作物中的殘留日益嚴重，而且可以通過代謝等途徑向環境中轉移，對人類健康構成潛在威脅，它會影響大腦發育，對甲狀腺系統產生作用，導致血液甲狀腺素濃度降低，過量攝取可能會引起痙攣以及眩暈，尤其對兒童健康危害較大。

有鑒于此，發達國家對毒死蜱的使用進行了嚴格的規定，并不斷提高毒死蜱在農產品中的殘留限量。歐盟對菠菜中毒死蜱的最高限量為0.05mg/kg；日本對毒死蜱的國家標準最為嚴格，其2002年4月公布的農殘限量標準表中，其菠菜的毒死蜱限量為0.01mg/kg；國際食品法典委員會(CAC)對菠菜中毒死蜱殘留限量為0.05mg/kg。我國最高殘留限量國家標準為：糧食0.1mg/kg；梨果、葉菜1mg/kg；棉籽油0.05mg/kg。

因此，為了預防和應對毒死蜱殘留引起的環境和食品污染問題，有必要建立一種靈敏、簡便、快速的毒死蜱檢測方法。目前毒死蜱的殘留檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣-質聯用法(GC-MS)。采用這些分析方法需要昂貴的儀器和專門的技術人員，樣品前處理過程復雜且花費高、費時長，難以滿足大量樣品和現場樣品快速檢測的需要。酶聯免疫吸附分析法(ELISA)具有簡便快速、特異靈敏、樣品容量大、分析成本低的特點，可以簡化甚至省去樣品凈化步驟，在大量樣本和現場樣本快速篩選檢測中顯示出獨特優勢，能夠更好地滿足我國食品企業、政府職能監管部門等開展檢測工作，極具發展潛力。

發明內容

本發明的目的在于提供一種結構簡單、使用方便、價格便宜、便于攜帶的用于毒死蜱檢測的酶聯免疫試劑盒，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣本篩選的定性、定量檢測方法。

本發明試劑盒，它包括：包被有毒死蜱偶聯抗原的酶標板、毒死蜱單克隆抗體、酶標記抗抗體、毒死蜱標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液；所述毒死蜱偶聯抗原是由毒死蜱半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原，所述毒死蜱半抗原是由毒死蜱原藥在堿性條件下與氨基丁酸在吡啶環上與鄰近氮原子的氯進行親核取代反應得到，分子結構式為：

所述毒死蜱單克隆抗體是以毒死蜱偶聯抗原作為免疫原制備獲得。

所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體。

所述酶標記抗抗體的標記酶為辣根過氧化物酶；酶標記的抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯得到的。

為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括毒死蜱標準品溶液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。

所述毒死蜱標準品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L和48.6μg/L。

所述底物顯色液由底物液A液和底物液B液組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，所述終止液為1～2mol/L的硫酸溶液。

所述洗滌液優選為pH值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01‰～0.03‰疊氮化鈉的0.1～0.3mol/L磷酸鹽緩沖液。

所述復溶液優選為pH值為7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。

其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白的0.1～0.3mol/L磷酸鹽緩沖液。

本發明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μL封閉液，37℃避光孵育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存。

本發明的檢測原理為：