[發明專利]制備DNA探針的方法、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201610629100.X
• 申請日: 2016-08-03
• 公開（公告）號: CN107686837A
• 公開（公告）日: 2018-02-13
• 發明（設計）人: 許勇;周昌茂;王學海;黃璐;馬錚;馬梵辛;肖強;劉哲
• 申請（專利權）人: 湖北生物醫藥產業技術研究院有限公司;武漢珂美立德生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/689;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

1.一種制備DNA探針的方法，其特征在于，包括：

(1)將大腸桿菌細胞基因組DNA進行超聲破碎處理，其中，在所述超聲破碎處理中，所述大腸桿菌細胞基因組DNA的濃度為20微克/毫升；以及

(2)將所述超聲破碎處理的產物與標記試劑進行孵育處理，以便獲得DNA探針，所述DNA探針攜帶所述標記。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述超聲破碎處理是在400W的條件下進行3h，

任選地，所述標記為地高辛。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，將0.32μg～0.64μg的所述超聲破碎處理的產物與0.64ng～1.28ng所述地高辛進行孵育處理，

任選地，所述地高辛來自DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit l中的Vial1試劑，

任選地，基于0.32μg～0.64μg的所述超聲破碎處理的產物，所述Vial1試劑的用量為4微升～8微升。

4.一種制備DNA探針的方法，其特征在于，包括：

1)將大腸桿菌細胞基因組DNA標準品用純化水稀釋至20μg/ml，用超聲儀進行超聲破碎處理，所述超聲破碎處理是在400W的條件下進行3h，

2)將經過超聲破碎處理的基因組DNA置于100℃下水浴10min、冰浴10min，

3)將來自DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kitl中4μl～8μl的vial 1試劑與16μl～32μl經過超聲破碎處理的基因組DNA混合，并短暫離心，37℃水浴孵育過夜，

4)加入2μl濃度為0.5M、pH為8.0的EDTA終止孵育反應，

5)加入2.5μl濃度為3M、pH為5.2的醋酸鈉和75μl預冷無水乙醇，-20℃放置2h以上，12000rpm的條件下離心15min，棄上清，

6)加入500μl預冷的70％乙醇，12000rpm的條件下離心5min，棄上清，獲得沉淀，

7)室溫晾干所述沉淀，并用50μl TE溶解沉淀，獲得所述探針DNA，

任選地，進一步包括將50μl所述探針DNA加入預熱的3.5ml雜交液，所述雜交液來自Roche試劑盒，以便獲得含有所述探針的雜交液。

5.一種試劑盒，其特征在于，包含DNA探針，所述DNA探針是利用權利要求1～4任一項所述的方法制備的。

6.一種檢測生物制品中大腸桿菌DNA含量的方法，其特征在于，包括：1)將待測生物制品、大腸桿菌基因組DNA陽性對照樣品進行變性和稀釋處理，所述稀釋處理是在鮭魚精DNA稀釋液中進行的；以及

2)利用DNA探針檢測生物制品中大腸桿菌的DNA含量，所述DNA探針是利用權利要求1～5任一項所述的方法制備的，

任選地，所述鮭魚精DNA稀釋液是通過如下方式制備的：

i)0.1g的鮭魚精DNA溶于10ml的TE緩沖液，

ii)將溶于TE緩沖液的鮭魚精DNA進行剪切處理，

iii)將經過剪切處理的鮭魚精DNA進行200倍的稀釋處理，所述稀釋處理是在TE緩沖液中進行的，以便獲得所述鮭魚精DNA稀釋液，

任選地，所述剪切處理是通過如下方式實現的：

利用7號針頭將溶于TE緩沖液的鮭魚精DNA進行反復抽打處理。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，利用DNA探針檢測生物制品中大腸桿菌的DNA含量是通過如下方式實現的：

比較第一雜交斑點的灰度和第二雜交斑點的灰度，進而確定待測生物制品中大腸桿菌的DNA含量，

其中，所述第一雜交斑點是通過所述DNA探針和所述待測生物制品進行雜交獲得的，

所述第二雜交斑點是通過所述DNA探針和所述大腸桿菌基因組DNA陽性對照樣品進行雜交獲得的。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌基因組DNA陽性對照樣品稀釋后的濃度分別為2ug/ml、0.2ug/ml、0.02ug/ml，所述待測生物樣品稀釋后的濃度為100ug/ml。