[發明專利]一種快速檢測異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖源性成分的方法

在審

• 申請號: 201610625279.1
• 申請日: 2016-08-02
• 公開（公告）號: CN106636322A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 宋薇;張斌;崔山;郭文宗
• 申請（專利權）人: 青島譜尼測試有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬食品檢驗技術領域，尤其涉及一種實時熒光PCR檢測用引物和探針以及利用該引物和探針對異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖源性成分進行鑒別檢測的方法。

背景技術

目前，國內用于檢測動物源性成分的技術主要有二種：酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和聚合酶鏈式反應(PCR)，在實際檢測中應用最多的是PCR法。PCR法可分為普通定性PCR和實時熒光PCR。實時熒光PCR技術是基于普通PCR技術基礎上發展而來的，其中，TaqMAN探針法實時熒光PCR是在擴增反應體系中添加一個特異性的熒光探針，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，即檢測靶核苷酸序列擴增狀態，以進行結果判定。它的主要優點是：(1)在閉管狀態下進行擴增產物檢測，無需PCR產物的后處理，避免了擴增產物污染而致的假陽性，保證了結果的可靠性；(2)探針雜交特異性更強，靈敏性更高，在普通PCR擴增的基礎上又多了一條可以與模板互補配對的熒光探針，提高了特異性，熒光信號由儀器自動收集，進一步提高了靈敏度；(3)無需酶切位點存在，無需進行酶切，電泳，節省了時間，PCR后無需后續處理，操作更簡單快速。

鱈魚肉味甘美、營養豐富。肉中蛋白質比三文魚、鯧魚、鰣魚、帶魚都高，而肉中所含脂肪和鯊魚一般只有0.5％，要比三文魚低17倍，比帶魚低7倍；肝臟含油量高，除了富含普通魚油所有的DHA、DPA外，還含有人體所必需的維生素A、D、E和其他多種維生素。鱈魚肝油中這些營養成分的比例，正是人體每日所需要量的最佳比例。因此，北歐人將它稱為餐桌上的“營養師”。

一般來說，鱈屬里的三種魚：大西洋鱈魚(Gadus morhua)，格陵蘭鱈魚(Gadus ogac)和太平洋鱈魚(Gadus macrocephalus)才稱得上傳統意義上純正的鱈魚。

但是市場上常有人用外表形態與鱈魚相似的“油魚”-蛇鯖魚混雜在鱈魚中，或直接以鱈魚之名售賣。蛇鯖魚包括兩種魚，異鱗蛇鯖(Lepidocybium flavobrunneum)和棘鱗蛇鯖(Ruvettus pretiosus)，它們體內肌肉和骨骼含有近20％的油脂，其中又以一種被稱作蠟酯的物質為多。這些蠟酯來自于蛇鯖的食物，同時對于維持它們的身體機能有很重要的作用。但是，人卻不能消化這種物質，如果一次攝入過多的話，就會引起腹痛、腹瀉、惡心和嘔吐等不良反應。

目前，還沒有快速鑒定異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖源性成分的方法，只能通過DNA條碼識別系統來鑒別，而DNA條碼識別技術涉及普通定性PCR、電泳、PCR產物回收和純化、測序、序列比對分析等程序，步驟繁瑣、周期較長。綜上所述，本領域迫切需要開發新的快速簡便地檢測異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖源性成分的技術。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種實時熒光PCR檢測異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖源性成分的引物和探針及方法。

實時熒光PCR檢測異鱗蛇鯖源性成分的引物和探針，分別為：

上游引物P1：TCCCTCGAATGAATAACATA

下游引物P2：CTCCTGAAGAGGCTAATAG

帶有熒光染料的探針序列為：TGACTTCTGCCTCCATCCTTCC

所述的熒光染料，5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記。

實時熒光PCR檢測棘鱗蛇鯖源性成分的引物和探針，分別為：

上游引物P1：CTCCTCCTATTATCCCTG

下游引物P2：CGAAGAAGGTTGTGTTTA

帶有熒光染料的探針序列為：TTACAATGCTCCTCACAGACCGAA

所述的熒光染料，5‘端為VIC標記，3’端為TAMRA標記。

實時熒光PCR檢測蛇鯖魚源性成分的方法，其步驟如下：

1、提取待檢樣品基因組DNA

2、將檢測異鱗蛇鯖和棘鱗蛇鯖的上游引物、下游引物和探針稀釋至10μmol/L，然后等體積合并為混合引物(探針)，以所提取的DNA作為模板，加入上述引物對和熒光染料標記的探針以及酶反應液進行實時熒光PCR反應，記錄樣品反應的Ct值；

所述的實時熒光PCR反應體系為：

3、所述的實時熒光PCR反應條件為95℃10min，1個循環；95℃，15s，58℃30s，40個循環，在每次循環的58℃/30s時收集熒光，設立FAM和VIC通道。

所述的實時熒光PCR方法還設有空白對照、陰性對照、陽性對照，判定標準為：