[發(fā)明專利]一種豬圓環(huán)病毒亞單位滅活疫苗

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610608443.8
• 申請(qǐng)日: 2016-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN106279431B
• 公開（公告）日: 2019-07-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張曉丹;李殿明;蒲勤;齊春梅;田春輝;劉甜甜;任百亮;張導(dǎo)春;黨將將;吳啟凡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島明勤生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;A61K39/12;A61P31/20
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本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒亞單位滅活疫苗的制備。所述疫苗包含PCV1主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白亞單位、PCV2主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白亞單位、豬白細(xì)胞介素?2及純化標(biāo)簽。本疫苗制備工藝穩(wěn)定，適合大規(guī)模生產(chǎn)。動(dòng)物試驗(yàn)表明，本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒亞單位滅活疫苗具有良好的安全性，且能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生顯著的體液免疫及細(xì)胞免疫，有效預(yù)防豬圓環(huán)病毒的感染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種用于免疫的融合蛋白，其由PCV1和PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白的亞單位、豬白細(xì)胞介素-2及純化標(biāo)簽序列串聯(lián)而成，然后克隆入載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、純化、乳化工藝制備成豬圓環(huán)病毒亞單位滅活疫苗，該疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生顯著體液免疫和細(xì)胞免疫，有效預(yù)防豬圓環(huán)病毒的感染。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒感染是由豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)引起的一種傳染病。主要臨床表現(xiàn)為體質(zhì)下降、消瘦、貧血、黃疸、生長(zhǎng)發(fā)育不良、腹瀉、呼吸困難、母豬繁殖障礙，內(nèi)臟器官及皮膚的廣泛病理變化，特別是腎臟、脾臟及全身淋巴結(jié)的高度腫大、出血和壞死。

豬圓環(huán)病毒為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，由Tischer于1974年首先在PK-15(ATCC-CCL)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。PCV有2種血清型，即PCV1和PCV2。已知PCV1對(duì)豬的致病性較低，偶爾可引起懷孕母豬的胎兒感染，造成繁殖障礙，但在正常豬群及豬源細(xì)胞中污染率極高。PCV2對(duì)豬的危害極大，主要侵害豬體的免疫系統(tǒng)，引起機(jī)體免疫抑制及抵抗力下降，從而繼發(fā)其它疾病。已證明是仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征發(fā)生的必要病原，此外，豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸道綜合征、母豬繁殖障礙等疾病的發(fā)生也與PCV2的感染有關(guān)。PCV基因組分為兩種基因型，即PCV1型基因組和PCV2型基因組。PCV1基因組全長(zhǎng)約1.7kb，PCV2約1.768kb。PCV1和PCV2的基因結(jié)構(gòu)極為相似，都含有11個(gè)ORFs，其中ORF1和ORF2是最主要的兩個(gè)ORF，ORF1編碼Rep和Rep’蛋白，主要參與病毒復(fù)制；ORF2編碼Cap蛋白，大小約27.8KD，是PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要的免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。基因序列分析發(fā)現(xiàn)，同一血清型中各毒株之間的核苷酸序列同源性在96％以上，而不同血清型核苷酸序列同源性低于80％。PCV1和PCV2之間與復(fù)制有關(guān)的DNA復(fù)制起始區(qū)和Rep蛋白基因序列同源性分別為79.5％和82％；而Cap蛋白基因存在較大差異，同源性只有62％左右。

自PCV發(fā)現(xiàn)以來(lái)，PCV1和PCV2已被證實(shí)為世界性流行和存在的病毒，我國(guó)由郎洪武等2001年首次從豬群中分離到PCV2，目前各豬場(chǎng)已普遍存在。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)豬群陽(yáng)性率高達(dá)52.8％-100％。該病發(fā)病率高達(dá)50％，死亡率因豬場(chǎng)條件、繼發(fā)感染等情況而不同，一般在5％-70％，是目前造成養(yǎng)豬業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的主要傳染病之一。目前，商品化疫苗主要有桿狀病毒表達(dá)的亞單位疫苗和PCV2滅活疫苗，抗原純度不高且價(jià)格昂貴，加上體外培養(yǎng)PCV比較困難，病毒滴度較低，因而急需研制安全有效的新型疫苗來(lái)預(yù)防豬圓環(huán)病毒的感染。

白介素-2(Interleukin-2，IL-2)又稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是由輔助性T細(xì)胞(THC)分泌的一種糖蛋白。IL-2在體外能促進(jìn)T細(xì)胞分化成熟和擴(kuò)增，促進(jìn)THC的增長(zhǎng)，刺激NK細(xì)胞生長(zhǎng)并增強(qiáng)其溶細(xì)胞功能，增強(qiáng)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用，是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子。IL-2在特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，將IL-2與保護(hù)性抗原基因連接構(gòu)成融合蛋白，可以增強(qiáng)亞單位疫苗的抗體產(chǎn)生和細(xì)胞免疫水平。本發(fā)明提供了一種新的用于免疫的融合蛋白及其疫苗組合物，能有效預(yù)防豬圓環(huán)病毒的感染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明根據(jù)不同結(jié)構(gòu)蛋白在PCV病毒感染中的作用，選擇PCV1和PCV2主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白亞單位作為疫苗框架結(jié)構(gòu)，通過(guò)柔性Linker連接后再與豬白介素-2串聯(lián)，克隆入pRSETB載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗。利用本發(fā)明制備的疫苗可以有效預(yù)防豬圓環(huán)病毒的感染。