[發(fā)明專利]一種利用納米微球時間分辨熒光探針檢測四環(huán)素的方法

在審

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• 申請日: 2016-07-25
• 公開（公告）號: CN107655864A
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發(fā)明（設計）人: 莊捷;張玲;楊小如;梁俊;張琪
• 申請（專利權）人: 上海溯源生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海弼興律師事務所31283
• 代理人: 薛琦,蔣舫瑋

技術領域

本發(fā)明屬于檢測技術領域，具體涉及一種利用納米微球時間分辨熒光探針檢測四環(huán)素的方法。

背景技術

時間分辨熒光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是上世紀80年代提出的一種較為新型的檢測手段，TRFIA是用稀土離子作為示蹤物標記蛋白質、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細胞,與其螯合劑、增強液(有一部分不需要)在待反應體系(如:抗原抗體免疫反應、生物素親和素反應、核酸探針雜交反應、靶細胞與效應細胞的殺傷反應等)發(fā)生反應后,用時間分辨熒光儀測定最后產物中的熒光強度,根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值,推測反應體系中分析物的濃度,達到定量分析的目的。TRFIA與化學發(fā)光、電化學發(fā)光免疫檢測技術并稱為三大超靈敏檢測技術，在食品檢測、醫(yī)學臨床檢測、生物學科研檢測以及環(huán)境檢測等方面有較為廣泛的應用。

由于稀土元素絡合物的熒光強度都較低，因此需要采用熒光增強技術來提高檢測靈敏度。目前，根據(jù)信號增強技術的不同，TRFIA可分為三種類型，解離再增強技術(DELFIA)、Cyber Fluor系統(tǒng)和基于納米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。其中，Nano-TRFIA是一種全新的時間分辨熒光檢測手段，它結合了稀土元素熒光的長壽命和納米微球的信號放大效應，將稀土元素及其配合物共同摻雜在納米及微球上，經過表面活化后，將抗體標記于標記物表面，形成復合物，將該復合物用于免疫檢測，可極大地提高靈敏度，并獲得較為寬闊的線性范圍。

四環(huán)素是一種廣譜抑菌劑，在高濃度時其具有殺菌作用，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制 作用。目前亟待獲得快速、簡便、可靠、準確地檢測四環(huán)素的方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題就是針對現(xiàn)有的、缺乏快速、簡便、可靠、準確地檢測四環(huán)素的方法不足，提供一種利用納米微球時間分辨熒光探針檢測四環(huán)素的方法。所述的方法能夠快速、可靠、準確地檢測四環(huán)素的含量，并且靈敏度高、重復性好、穩(wěn)定性高、節(jié)約時間。該方法能夠廣泛用于商業(yè)化對四環(huán)素的檢測。

本發(fā)明通過對納米微球時間分辨熒光探針的結構，尤其是對其組成部分納米熒光微球的制備原料中稀土元素離子、β-二酮類螯合劑和熒光增強協(xié)同劑的品種和組成進行特定選擇，使稀土元素離子、β-二酮體類螯合物和熒光增強協(xié)同劑的摩爾比為1∶3∶3～1∶3∶4，從而使制備的納米熒光微球的熒光強度極大地提高，有利于提高利用含有該納米熒光微球的納米微球時間分辨熒光探針檢測四環(huán)素含量的靈敏度、準確性和可靠性。

本發(fā)明的技術方案是：一種利用納米微球時間分辨熒光探針檢測四環(huán)素的方法，其包括以下的步驟：

(1)制備羧基化聚苯乙烯納米微球；

(2)利用步驟(1)制備的羧基化聚苯乙烯納米微球，制備納米熒光微球；所述納米熒光微球中，稀土元素離子、β-二酮體類螯合物和熒光增強協(xié)同劑的摩爾比為1∶3∶3～1∶3∶4；

(3)利用步驟(2)制備的納米熒光微球和四環(huán)素單克隆抗體，制備納米微球時間分辨熒光-四環(huán)素探針；利用步驟(2)制備的納米熒光微球和兔IgG單克隆抗體制備納米微球時間分辨熒光-兔IgG探針；

(4)凍干步驟(3)制備的納米微球時間分辨熒光-四環(huán)素探針和納米微球時間分辨熒光-兔IgG探針，得到凍干的納米熒光微球標記的四環(huán)素單克隆抗體和和凍干的納米熒光微球標記的兔IgG單克隆抗體；

(5)利用四環(huán)素制備檢測線T線，利用羊抗兔二抗制備質控線C線， 噴涂、組裝獲得層析試紙條；

(6)將步驟(4)制備的凍干的納米熒光微球標記的四環(huán)素單克隆抗體和和凍干的納米熒光微球標記的兔IgG單克隆抗體加入到酶標板的孔中；

(7)取待測樣品加入步驟(6)的酶標板的孔中；

(8)向步驟(7)的酶標板的孔中插入步驟(5)制備的層析試紙條，樣品墊一端浸入到所述孔中的液體0.5cm，浸入5min后插入熒光讀數(shù)儀中讀數(shù)，得到檢測結果。

本發(fā)明中，較佳地，步驟(1)所述羧基化聚苯乙烯納米微球，由包括以下步驟的方法制得：

將10mM苯乙烯單體和0.95mM丙烯酸單體溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸鈉的去離子水中，再加入圓底燒瓶，用磁力攪拌子攪拌均勻；

用高純氮氣將圓底燒瓶中的空氣除盡，密封加熱至70℃。加入0.15mM過硫酸鉀0.5mL，密封隔氧攪拌反應8小時后，降至室溫；