[發明專利]一種生產2-氧-α-D-吡喃葡糖基抗壞血酸的方法及其專用工程菌

有效

• 申請號: 201610565717.X
• 申請日: 2016-07-18
• 公開（公告）號: CN107630057B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 胡美榮;王雷;彭穎;陶勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12P19/60
• 分類號: C12P19/60;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;何葉喧

本發明公開了一種生產2?氧?α?D?吡喃葡糖基抗壞血酸的方法及其專用工程菌。本發明提供了一種生產2?氧?α?D?吡喃葡糖基抗壞血酸的方法，包括如下步驟：以抗壞血酸類物質和蔗糖為原料，在工程菌的作用下，生產2?氧?α?D?吡喃葡糖基抗壞血酸；所述工程菌為表達功能蛋白的重組菌，是將編碼所述功能蛋白的功能基因導入出發菌得到的；所述功能蛋白為序列表的序列1所示的蛋白質或序列表的序列3所示的蛋白質；所述抗壞血酸類物質為抗壞血酸或抗壞血酸鹽。本發明提供的方法以價格低廉的蔗糖和抗壞血酸為原料，實現一步酶法生成AA?2G，具有反應條件溫和、無污染、工藝路線簡單、適合大規模的工業化生產等顯著特點。

技術領域

本發明涉及一種生產2-氧-α-D-吡喃葡糖基抗壞血酸的方法及其專用工程菌。

背景技術

2-氧-α-D-吡喃葡糖基抗壞血酸(2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbic acid，AA-2G)是一種重要的生物化合物。

AA-2G是抗壞血酸(維生素C，L-ascorbic acid，AA)的一類重要的衍生物，是由AA的C2位上的羥基被葡萄糖基所修飾形成的化合物，由于C2位上有葡萄糖基掩蔽，不易發生AA的氧化反應，所以在水溶液中特別穩定，并且沒有直接還原性，有效地保護了其生物活性。

AA-2G與AA具有相同的溶膠原活性，可以用于增強人體皮膚細胞中膠原的合成，還可以預防和治療由紫外線照射引發的急性病癥。在人體內酶系的綜合作用下，AA-2G非常容易的分解為D-葡萄糖和AA，分解得到的AA與一般的AA有相同的生理功能，D-葡萄糖也可以被人體吸收，所以AA-2G安全性極高。AA-2G既可保持AA分子的穩定性，又可使其在人體細胞中轉化為具有活性功能的烯二醇結構，是最佳的AA替代品，目前廣泛應用于化妝品、食品、醫療保健以及畜牧業和水產養殖等行業。

目前，全世界應用于化妝品中的AA-2G幾乎全部由日本林原公司一家提供，其在市場上占有壟斷的地位。AA-2G的價格約為1000元/kg，大概是抗壞血酸的50多倍，其市場價值巨大。我國是抗壞血酸的生產大國，然而抗壞血酸的產品約四分之三用于出口，內銷產品主要用于醫藥，品種較為單調，對于抗壞血酸衍生物產品(如AA-2G)的生產尚處于初步探索階段。

AA-2G的化學合成十分困難，目前主要采用酶法轉化，首先利用糖基轉移酶(glycosyl-transferase)的轉糖基作用將葡萄糖基供體(如淀粉、環糊精、麥芽糊精、麥芽糖等)上的葡萄糖苷轉移到AA的C2位上，根據連接的葡萄糖鏈長短的不同，得到產物為AA-2Gn(n＝1，2，3，4，5，6，7)，再利用葡糖淀粉酶(glucoamylase)將AA-2Gn較長的糖鏈降解為成只連接一個葡萄糖基團的AA-2G。由于環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)的強產物特異性，使其成為目前AA-2G生物合成中使用最廣泛的酶種，例如，江南大學的陳堅等人利用改造后的CGTase，提高其對麥芽糊精的底物特異性，并以麥芽糊精為糖基供體生產AA-2G，產量達到1.66g/L。另有人通過改造CGTase，提高其對麥芽糖的底物特異性，并以麥芽糖為糖基供體生產AA-2G，產量達到1.01g/L。

現有技術中使用CGTase酶生產AA-2G的主要問題在于：⑴通常以α-環糊精或β-環糊精為糖基供體，然而α-環糊精成本太高，β-環糊精溶解度較低；⑵對于麥芽糊精、麥芽糖等成本較低的底物特異性差，轉化率低；⑶利用CGTase得到的產物為AA-2Gn，還需要葡糖淀粉酶的降解，增加了酶的成本。

綜上所述，本領域迫切需要開發新的高效生產AA-2G的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種生產2-氧-α-D-吡喃葡糖基抗壞血酸的方法及其專用工程菌。