[發明專利]人α?防御素5改造體及其應用

有效

• 申請號: 201610561665.9
• 申請日: 2016-07-14
• 公開（公告）號: CN106146643B
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: 方向明;雷如意;陳齊興;侯金超;程寶莉;金悅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;A61K38/17;A61P31/00;A61P37/02
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及人α-防御素5改造體及其應用。

背景技術

抗生素耐藥是威脅人類健康的重大科學問題。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、泛耐藥鮑曼不動桿菌、耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌等廣譜甚至超廣譜耐藥菌的出現使得一些感染的治療相當棘手，成為這些感染患者死亡的重要危險因素。目前耐藥菌突變的速度快于新型抗菌藥物的研發速度，人類對于一些耐藥菌感染無能為力，面臨“后抗生素時代”的嚴峻挑戰。因此，探尋新型的抗菌藥物，尤其是對廣譜和超廣譜耐藥菌具有殺菌能力的新藥，已經迫在眉睫。

陽離子抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，是生物體對抗外界微生物侵襲的一道重要的免疫防線。陽離子抗菌肽的抗菌作用具有殺菌快速、作用廣譜和難以形成抗性的特點，這使得其成為理想的候選新型抗生素。陽離子抗菌肽作用機理是其帶正電荷，可與帶負電荷的細菌表面結合，嵌入細菌的細胞膜內，形成孔洞，破壞其細胞膜的連續性，使其細胞質外流，最終導致細菌的死亡，區別于傳統抗生素的殺菌靶點如蛋白體、RNA酶等，殺菌效果直接快速強大，且不易誘導傳統的依賴基因突變、水解酶產生等的耐藥性。一些抗菌肽作為抗耐藥細菌的抗菌素，已進入臨床試驗(M.Zasloff，Nature，2002，415，389-395)。

人α-防御素5(human defensin-5，HD-5)是一種主要表達于腸道粘膜的天然陽離子抗菌肽，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、產氣腸桿菌等多種細菌及真菌均具有較強的殺菌作用。此外，HD-5還可以通過調節腸道局部炎癥因子的釋放發揮免疫調節作用。因此，HD-5在腸道免疫屏障中發揮極其重要作用。

盡管目前HD-5的提取及人工合成已較成熟，但是由于完全仿生天然的HD-5抗菌活性容易受到諸多機體內環境因素的影響，如生理濃度的氯化鈉的存在即可極大地降低其抗菌活性，限制其成為適宜產業化開發生產、臨床應用的新型抗菌藥物。

因此，本發明根據HD-5的理化性質對HD-5進行改造，克服HD-5的功能缺陷，使其有望成為應用于臨床的新型抗菌藥物。

發明內容

本發明提供了一種人α-防御素5改造體，在人α-防御素5的C端連接不同長度的脂肪酸鏈，使其成為陽離子兩親性自組裝納米抗菌肽，獲取了作用穩定、高效、適宜產業化生產且具備多種功能的人工抗菌肽。

人α-防御素5改造體，由人α-防御素5在C末端添加氨基酸殘基并修飾連接脂肪酸改造獲得，所添加的氨基酸殘基中至少有一個氨基酸殘基具有游離氨基，所述游離氨基上修飾連接碳原子數為8-24的脂肪酸。

本發明的改造以HD-5為模板，HD-5由32個氨基酸殘基組成，其中有6個半胱氨酸，按N端到C端的順序排列，第1個和第6個、第2個和第4個、第3個和第5個半胱氨酸之間分別兩兩形成二硫鍵，一共3個二硫鍵。本發明在其C端進行了延伸，最終得到了本發明的改造體。

研究表明，對HD-5的C端進行脂肪酸鏈修飾，能夠顯著提高人α-防御素5的殺菌活性，而且C端修飾得到的改造體較N端修飾具備更強的殺菌能力。

本發明改造體具備殺菌力強而溶血率低的特點。作為優選，所述脂肪酸的碳原子數為12-14個。更為優選的，所述脂肪酸為肉豆蔻酸或月桂酸。

本發明通過在C端添加氨基酸延長肽鏈，利于脂肪酸的修飾。作為優選，添加的氨基酸殘基的數量為2-5個。

脂肪酸的修飾是通過脂肪酸的羧基與C端氨基酸殘基上的游離氨基發生脫水縮合反應實現。因此，HD-5改造體C端添加氨基酸至少有一個為至少帶有兩個氨基的氨基酸，如Lys，其中α氨基用于合成肽鏈的肽鍵，側鏈上氨基用于脂肪酸鏈的修飾。

作為優選，所述改造體的肽鏈由34個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為：