[發明專利]一種馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202010015249.5
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111004776A
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 格日樂其木格;趙雅麗;張心壯;才文道力瑪;曹迪;納日嘎;芒來
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京知呱呱知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 杜立軍

本發明實施例公開了一種馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其包括將馬肌肉塊滅菌、清除脂肪組織和結締組織后，粉碎成塊狀肌肉組織；將所述塊狀肌肉組織經胰蛋白酶消化后，離心分離得到第一上清液和第一沉淀物；將所述第一上清液離心，得到第二上清液和第二沉淀物，棄所述第二上清液，將所述第二沉淀物用增殖培養液重懸、離心后，得到第三上清液和第三沉淀物，棄所述第三上清液，將所述第三沉淀物增殖培養液懸浮，過細胞過濾器，收集第一濾液，將所述第一濾液離心后，得到第四沉淀物。本發明實施例通過純化提高骨骼肌衛星細胞的數量和純度，為研究肌肉生長、肌肉損傷等科研院校提供了一種準確的骨骼肌衛星細胞的分離培養方法。

技術領域

本發明實施例涉及細胞培養技術領域，具體涉及一種馬的骨骼肌衛星細胞的培養體系。

背景技術

目前，賽馬和娛樂用馬是未來馬產業發展的主流，而馬在運動過程中肌肉會根據運動量的大小受到不同程度的損傷，使馬的運動性能受到影響，而在賽馬和馬術運動中馬具有良好的運動性能是必要的條件。骨骼肌衛星細胞是骨骼肌中具有增殖、分化的肌源性干細胞，在骨骼肌再生過程中起著不可或缺的作用，骨骼肌衛星細胞在機體成年后大部分是靜止的，只會在組織受到損傷時，才會被激活進行增殖、分化，促進肌纖維的修復。骨骼肌衛星細胞是用于研究肌肉生長發育，損傷與修復，與肌肉相關的疾病等方面的重要細胞模型。

發明內容

為此，本發明實施例提供一種馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，以解決現有技術中的缺乏有效對馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法問題。

為了實現上述目的，本發明實施例提供如下技術方案：

一種馬骨骼肌衛星細胞的分離培養方法，其包括將馬肌肉塊滅菌、清除脂肪組織和結締組織后，粉碎成塊狀肌肉組織；

將所述塊狀肌肉組織經胰蛋白酶消化后，離心分離得到第一上清液和第一沉淀物；

將所述第一上清液離心，得到第二上清液和第二沉淀物，棄所述第二上清液，將所述第二沉淀物用增殖培養液重懸、離心后，得到第三上清液和第三沉淀物，棄所述第三上清液，將所述第三沉淀物增殖培養液懸浮，過細胞過濾器，收集第一濾液，將所述第一濾液離心后，得到第四沉淀物；

將所述第一沉淀物經過膠原酶消化處理后，過細胞過濾器，得到第二濾液，將所述第二濾液離心后，得到第四上清液和第五沉淀物，將所述第四上清液進一步離心得到第六沉淀物，將所述第五沉淀物和第六沉淀物混合后，用增殖培養液懸浮，離心后得到第五上清液和第七沉淀物；

將所述第四沉淀物懸浮液和和第七沉淀物懸浮液混合，離心，得到第六上清液和第八沉淀物；

所述第八沉淀物用增殖培養液懸浮，經細胞過濾器過濾后，得到第三濾液，將所述第三濾液離心，得到第九沉淀物馬骨骼肌衛星細胞；

將所述第九沉淀物用增殖培養液懸浮，培養，通過差速貼壁法純化得到純化的馬骨骼肌衛星細胞。

優選的，所述馬肌肉塊滅菌采用70％乙醇浸泡滅菌。

優選的，所述馬肌肉塊粉碎前，用含有青霉素鏈霉素的DPBS沖洗所述馬肌肉塊直至DPBS澄清無血色。

優選的，所述胰蛋白酶的質量分數為0.25％。

優選的，所述離心過程為700rpm-2000rpm，離心時間為5-15min。

優選的，所述第一濾液、第二濾液均采用70μm細胞過濾器，所述第三濾液采用40μm過濾器。

優選的，所述增殖培養液包括以下質量分數的原料：20％胎牛血清，1％青霉素鏈霉素和兩性霉素B以及余量的DMEM。

優選的，所述膠原酶為Ⅳ型膠原酶，其通過DMEM稀釋濃度至1mg/1mL。

本發明實施例具有如下優點：