[發明專利]一類用于檢測細胞膜附近一氧化氮的雙光子熒光探針

在審

• 申請號: 201610556522.9
• 申請日: 2016-07-14
• 公開（公告）號: CN107619390A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 肖義;張新富;陳令成;王超
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C07D221/14
• 分類號: C07D221/14;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 大連星海專利事務所有限公司21208
• 代理人: 楊翠翠

技術領域

本發明涉及一類檢測細胞膜附近一氧化氮的雙光子熒光探針，其屬于精細化工技術領域。

背景技術

一氧化氮是氮的氧化物，其化學性質活潑，20世紀末期被證明具有重要的生理調節功能，例如在心血管系統、神經系統中調解血管的舒張，在免疫系統中具有殺菌、抗腫瘤等作用；而其在細胞或組織內的代謝紊亂，會引起高雪氏病、空腔癌等疾病。因此，高靈敏、高選擇性的檢測機體內的一氧化氮具有重要的醫學意義。

熒光顯微技術作為一種直觀實時的監測手段適合用于活細胞或組織的實時檢測。而作為細胞的門戶，細胞膜是接受外界信號分子調解作用的第一站；對于個別細胞系細胞膜也是一氧化氮生成的主要位置，即為一氧化氮調解作用的發起點。然而目前尚無可用于檢測細胞膜附近一氧化氮的熒光探針。因此，我們設計了一系列具有細胞膜靶向功能的一氧化氮熒光探針分子，為一氧化氮相關疾病的研究提供更直觀和簡潔的研究工具。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一系列用于靶向細胞膜并能檢測細胞膜附近一氧化氮分子的熒光探針及其制備方法，系列探針可快速穩定定位于細胞膜，并能通過單光子及雙光子激光激發進行熒光成像。

本發明采用的技術方案是：靶向細胞膜并能檢測細胞膜附近一氧化氮的熒光探針，以萘酰亞胺為母體，具有如下結構通式：

通式中n＝0、1、2、3或4；其中：R₂＝CH₃、X^-＝Cl^-、Br^-、I^-、SO₄^2-、ClO₄^-、BrO₄^-或IO₄^-；R₁＝C₈-C₁₈直鏈或支鏈烷基。

一類用于檢測細胞膜附近一氧化氮分子的熒光探針的制備方法，所述熒光探針制備方法為：

以1摩爾含有2-氯乙胺(或碳數更多的氯代伯胺)與相應的仲胺溶于DMF、乙腈、丙酮或DMSO等溶劑，加入與2-氯乙胺摩爾比為1:5的碳酸鉀和碘化鉀在30-130℃下反應3-24h，得到中間體A1；中間體A1與化合物A2以摩爾比為5:1-1:1在無水醋酸鈉(與A2為0.1-10.0摩爾當量)的催化下加熱至100-130度反應5-9h，通過氧化鋁柱分離提純，得到中間體A3；中間體A3溶于過量的5mol/L的硫酸中，回流反應2h－5h，停止反應，趁熱倒入碎冰中，使用NaOH調節pH至弱堿性，有黃色固體從溶液中析出，過濾得到中間體A4，無需提純直接用于下一步反應；中間體A4與4-溴-1，8-萘二甲酸酐加入到20mL冰醋酸中，加熱回流6h，停止反應，反應液倒入碎冰中，使用氫氧化鈉調節至堿性，使用二氯甲烷萃取，利用中性氧化鋁柱分離提純，得到中間體A5；中間體A5和過量烷基胺加入到8mL DMSO中，100-150℃攪拌3h，使用二氯甲烷與水萃取，有機相使用硅膠柱分離提純，得到中間體A6；將A6溶于少量二氯甲烷中，室溫攪拌，加入季氨化試劑，繼續攪拌1－24h，中間體A7從溶劑中析出，過濾得到固體中間體A7；A7在四氫呋喃中使用鈀碳催化，加氫還原48h，濾液減壓旋干，使用二氯甲烷和正己烷重結晶提純，得到黃色粉末，即目標探針；所述熒光探針與含有不同陰離子的鈉鹽或是鉀鹽在甲醇中攪拌24h，使之進行離子交換，得到含有不同反離子的熒光探針。

所述熒光探針可以快速、穩定的停留在細胞膜上，并通過熒光信號的增強指示細胞膜附近一氧化氮分子的存在；系列探針分子不僅可以通過單光子激光激發進行熒光成像，更可實現690nm－950nm的雙光子激光進行熒光成像，適合細胞及深層次生物組織內部進行熒光檢測。