[發(fā)明專利]一種大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610556064.9
• 申請日: 2016-06-30
• 公開（公告）號: CN107557329A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田瑞;張亞洲;蔣敏;齊來俊
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是研究血一腦屏障及腦多種疾病的一個(gè)重要模型，分離純化腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究腦內(nèi)皮細(xì)胞的生理和病理特性提供了有效的技術(shù)支持。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有很多自身特性，如細(xì)胞活性低，分離的細(xì)胞容易受到成纖維細(xì)胞、平滑肌等雜細(xì)胞污染等等問題，為此分離培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵步驟之一就是獲得純度較高的微血管片段。常規(guī)方法多采用玻璃勻漿法及尼龍濾網(wǎng)過濾的方法來獲得微血管片段。但這些方法存在著微血管活性損傷大及獲得率低等問題；本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械酶消化法，并結(jié)合連續(xù)密度梯度離心法獲得純度較高的腦微血管片段，將其放置特制的細(xì)胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基中，分離的內(nèi)皮細(xì)胞活性好，純度高，該實(shí)驗(yàn)具有穩(wěn)定的可重復(fù)性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一種可獲得產(chǎn)量高、純度高且生存時(shí)間較長的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

為了解決解決上述所涉及到的問題，本發(fā)明采取如下方法獲得大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞：

大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，包括步驟：(a)大鼠頸椎脫臼處 死，消毒并斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦；(b)在無菌條件下，剝離解剖去除小腦、間腦以及去除軟腦膜和腦膜大血管等，保留大腦皮質(zhì)；(c)通過機(jī)械酶消化法，并結(jié)合連續(xù)密度梯度離心法獲得純度較高的腦微血管片段；(d)將純化的腦微血管片段鋪置特制的細(xì)胞培養(yǎng)皿，并使用兩種不同的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

可選的大鼠為25-50g，2-3周齡的SD大鼠；

可選的分離大腦皮質(zhì)是在預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，解剖去除小腦、間腦；將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以吸除軟腦膜及腦膜大血管；置于新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜；

可選的機(jī)械酶消化法是將剝離干凈的大腦皮質(zhì)剪碎成約1mm³大小，加入混合酶液I，混勻，37℃水浴消化1-1.5h；1 000×g室溫離心8min，去上清液；沉淀中加入一定濃度的BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g 4℃離心20min，去上清；沉淀加入4ml混合酶液II重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h；700×g室溫離心6min，去上清液；所述的混合酶液I是0.05-0.1％II型膠原酶，0.025-0.05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI，所述的BSA濃度為15-30％，所述的混合酶液II是0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI；

可選的連續(xù)密度梯度離心法獲得純度較高的腦微血管片段是通過將消化后離心的沉淀重懸浮，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 30-50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1 000×g，4℃離心10min，吸取中間白黃色的層面，用DMEM漂洗兩次(離心1 000×rpm，6min，室溫)，去上清液；

可選的特制細(xì)胞培養(yǎng)皿是用含5％的大鼠血清37℃孵育過夜所制備的；

可選的使用不同的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞為離心沉淀加入 DMEM完全培養(yǎng)液(10-20％FBS，2-6ug/mL嘌呤霉素)重懸浮，接種于特殊制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液；

可選的混合培養(yǎng)基為5％-10％的大鼠血清，10-20％FBS，10-100μg/mL牛垂體和下丘腦提取物，1ng/mL bFGF以及RPMI1640、DMEM/F12(1∶1)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法中使用的機(jī)械法、兩步酶消化法以及純化方法，節(jié)省了消化所需時(shí)間，提高細(xì)胞的產(chǎn)率和存活率以及細(xì)胞的純度；

本發(fā)明提供一種特制細(xì)胞培養(yǎng)皿和混合培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法，增加了微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生存期，提高細(xì)胞活性；

本發(fā)明解決了細(xì)胞損傷大、獲得率低、純度不高等問題，分離的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)率高，活性好，純度高，該實(shí)驗(yàn)具有穩(wěn)定的可重復(fù)性。

附圖說明

圖1：大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞(×100)

圖2：鑒定大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光電鏡(×100)

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)勢更清新地展現(xiàn)，現(xiàn)將具體實(shí)施方式進(jìn)一步闡述，此處所闡述的具體實(shí)施方式僅針對本發(fā)明進(jìn)行解釋，并不用于限定本發(fā)明。