[發明專利]腦多頭蚴病的標志物GP50以及用于診斷腦多頭蚴病的試劑盒

有效

• 申請號: 201610554272.5
• 申請日: 2016-07-14
• 公開（公告）號: CN106018831B
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 楊光友;黃興
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵

技術領域

本發明屬于動物疾病診斷領域，具體涉及一種腦多頭蚴病的標志物GP50以及用于診斷腦多頭蚴病的試劑盒。

背景技術

腦多頭蚴病(Coenuriasis)又叫腦包蟲病，是由多頭帶絳蟲(Taenia multiceps)的中絳期幼蟲腦多頭蚴(Coenurus cerebralis)寄生于牛、羊等偶蹄動物的腦和脊髓等處引起的一種寄生蟲病。該病呈世界性分布，常引起患病動物發生死亡，給畜牧業造成巨大經濟損失，同時人也有感染的報道。

多頭蚴病的臨床表現多樣，而且在動物感染后的一段時間內不出現典型的臨床癥狀，所以在感染早期難以確診。多樣的臨床表現導致了臨床診斷的復雜性和迫切需要更可靠的診斷工具。

醫學影像技術已經用于人腦多頭蚴病的診斷，主要是應用MRI和CT掃描來識別人腦部的包囊。這些技術同樣也可以用在動物腦多頭蚴的診斷上，Manunta等(2012)研究了33只患慢性腦多頭蚴病的綿羊和1只患病山羊的腦和頭骨的MRI特征，提示患病綿羊和山羊顱腔形態異常，內含大量的包囊。由于檢測結果的可信度高，MRI和CT掃描被認為是診斷人和動物腦多頭蚴病最好的方法，但是這些先進的診斷方法不易在養殖場實施，檢測成本非常昂貴，而且MRI和CT掃描技術成功應用的前提條件是腦多頭蚴在中樞神經系統內定居并形成一定大小的包囊，所以此類技術并不能在感染的早期進行診斷。

現代分子生物學技術已經用于腦多頭蚴病的診斷，Ahmad Oryan等(2015)提取患腦多頭蚴病的綿羊和山羊腦脊液DNA，以多頭帶絳蟲線粒體基因COX1序列設計引物，建立了檢測小型反芻動物腦多頭蚴病的PCR診斷方法，研究表明多頭帶絳蟲DNA存在于感染腦多頭蚴的綿羊和山羊腦腦脊液中，能夠被所建立的PCR診斷方法所擴增。該診斷方法具有較高的準確性，但抽取動物的腦脊液操作煩瑣，且不能進行早期診斷。

傳統的血清學診斷技術已經用于腦多頭蚴病的早期診斷，目前已經建立了診斷多頭蚴病的ELISA、Dot-ELISA、間接血凝試驗(IHA)及斑點免疫金滲濾試驗(DIGFA)等方法，這些方法都具有較好的診斷效果，但其所用抗原為蟲體包囊液或原頭蚴等天然蟲體抗原，限制了此類方法在生產上的推廣及使用。

GPI錨定蛋白是一類依賴糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol,GPI)錨定連接在真核生物細胞膜表面的一類蛋白質。GPI錨定蛋白在許多生物進程中扮演著重要作用。Hancock等(2004)研究表明豬帶絳蟲GP50蛋白是一個GPI錨定在細胞膜表面的豬囊尾蚴的診斷蛋白，并成功建立了基于重組GP50蛋白檢測豬的豬囊尾蚴感染血清Western-blot方法。近年來，針對豬和人的豬囊尾蚴病已經建立了基于GP50重組蛋白的FAST-ELISA(Falcon assay screening test–enzyme-linked immunosorbent assay，FAST-ELISA)和QuickELISA診斷方法，其敏感性和特異性均較高，證實了GP50重組蛋白在豬囊尾蚴病上的診斷價值，但未見關于腦多頭蚴GP50(TmGP50)蛋白的相關研究報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是針對現有技術的問題，提供一種腦多頭蚴病的標志物以及用于診斷腦多頭蚴病的試劑盒。

申請人采用多頭帶絳蟲GP50重組蛋白作抗原，建立了檢測山羊腦多頭蚴病的間接ELISA診斷方法，其敏感性為95％，特異性為92.6％，能夠在感染后第2周檢測出山羊血清抗體陽性，與現有方法相比具有更早的檢出時間(提前7天)。此外，藥物治療組山羊在肌肉注射吡喹酮后約3周呈現血清抗GP50抗體陰性，一直持續至整個試驗結束。表明GP50重組蛋白可用于腦多頭蚴病的診斷以及藥物治療后的效果評價。

因此本發明提供了GP50重組蛋白制備腦多頭蚴病標志物中的應用。

本發明還提供了GP50重組蛋白在制備腦多頭蚴病診斷試劑盒中的應用。所述診斷試劑盒包括但不限于間接ELISA診斷試劑盒。

本發明所述應用中所述腦多頭蚴病的受檢樣品可以采用本領域技術人員公知的任何一種樣品，包括但不限于血液、唾液、尿液。優選的，所述腦多頭蚴病的受檢樣品為血清或血漿。

本發明所述GP50重組蛋白為GP50基因與表達載體連接后獲得的重組質粒在宿主細胞中誘導表達的蛋白。

在一些實施方案中，所述GP50重組蛋白的制備方法具體為提取山羊腦多頭蚴總RNA，RT-PCR技術擴增GP50基因，構建pET-32a-GP50表達載體并誘導表達的蛋白。