[發(fā)明專利]一種組織透明化液SUT及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610548601.5
• 申請(qǐng)日: 2016-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN107621462B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王志偉;王巍;張杰;范桄溥;閆宇鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王志偉
• 主分類號(hào): G01N21/59
• 分類號(hào): G01N21/59;G01N1/06
• 代理公司: 北京思格頌知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11635
• 代理人: 潘珺

本發(fā)明實(shí)施例涉及一種組織透明化液SUT，所述組織透明化液SUT主要由SDS和尿素及TritonX?100構(gòu)成。本發(fā)明還涉及該組織透明化液SUT制備及其應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)施例提供的組織透明化液SUT降低了透明化液配制的成本及難度，增加了透明化效果，其對(duì)心肌的透明化程度優(yōu)于部分現(xiàn)有透明化液配方。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種組織透明化液SUT及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

在單細(xì)胞分辨率水平獲取可視化的、完整的組織結(jié)構(gòu)信息是科學(xué)家們一直以來的夢(mèng)想。通過對(duì)完整組織進(jìn)行單細(xì)胞分辨率成像，可以獲得完整組織的三維立體圖像，借此可以在器官和系統(tǒng)水平闡明細(xì)胞間連接方式及其動(dòng)態(tài)變化，這將會(huì)大大提高我們對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識(shí)，因?yàn)榧膊≈袉渭?xì)胞事件最終會(huì)導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體健康狀況的改變。但組織器官的不透光性成為實(shí)現(xiàn)這一夢(mèng)想的最大阻礙。

經(jīng)典的蛋白定性定量(即確定是哪種蛋白，確定某種蛋白的含量多少)技術(shù)包括western blot、免疫組化、免疫熒光等，其中(1)western blot通過電泳技術(shù)將各種蛋白分隔開來，能對(duì)蛋白進(jìn)行基本的定性定量，但無法確定蛋白在組織中的空間分布位置，更無法獲取組織內(nèi)蛋白分布的三維立體圖像；(2)由于組織器官的不透光性，傳統(tǒng)的免疫組化與免疫熒光是針對(duì)組織切片(包括石蠟切片和冰凍切片)進(jìn)行,切片厚度<8μm，才利于光線透過及熒光染料的穿透。其中免疫組化得到的是二維圖片，無法分析蛋白在組織中的三維立體分布；免疫熒光可以通過對(duì)組織孵育熒光染料，然后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行三維重構(gòu)，得到蛋白分布的三維立體圖像，但傳統(tǒng)免疫熒光重構(gòu)的厚度受切片厚度的限制，得到的三維圖像厚度太小(<8μm)，對(duì)一些較大的細(xì)胞(如左室心肌細(xì)胞，直徑10～15μm)則無法顯示全貌，而且，如果組織切片太厚，熒光染料(如熒光抗體)則無法穿透組織進(jìn)行蛋白標(biāo)記，且共聚焦顯微鏡的發(fā)射光也無法穿透組織全層，因此三維重構(gòu)在應(yīng)用上有很大的局限，目前多用于拍攝熒光二維圖片。

由于組織器官的不透光性和傳統(tǒng)研究技術(shù)的種種局限，我們無法獲得完整組織中的蛋白分布情況，試想，如果有一種方法能夠使組織擁有足夠大的光透過度，從而使共聚焦顯微鏡的發(fā)射光能夠穿透組織全層，且通過對(duì)組織進(jìn)行特定處理使得熒光染料也能夠穿透組織全層，那么，對(duì)較厚的完整組織的單細(xì)胞分辨率成像以及獲取蛋白在完整組織中的時(shí)間空間分布即可實(shí)現(xiàn)，這將對(duì)揭開生命的奧秘提供一種新的路徑，大大提高我們對(duì)生命體的認(rèn)識(shí)，同時(shí)將會(huì)大大提高我們對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展過程的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)人類的健康事業(yè)。

影響組織光透過度的因素有兩個(gè)：(1)光散射--主要因?yàn)椴煌M織結(jié)構(gòu)層間折射率的差異，其中脂質(zhì)成分影響最大；(2)光吸收--主要由于內(nèi)源性生色基團(tuán)，其中血紅蛋白和肌紅蛋白占主導(dǎo)。那么提高組織光透過率也相應(yīng)的有兩個(gè)途徑：(1)盡可能減少不同組織結(jié)構(gòu)層間折射率的差異，盡可能除盡脂質(zhì)；(2)盡可能除盡組織中的血液及肌紅蛋白。

組織透明化首先通過多聚甲醛固定組織蛋白、再與丙烯酰胺交聯(lián)形成組織凝膠復(fù)合物，組織凝膠復(fù)合物有兩個(gè)特點(diǎn)：(1)這種復(fù)合物可以將蛋白及核酸固定在原位，并可代替脂質(zhì)，成為構(gòu)架起細(xì)胞的支撐性結(jié)構(gòu)，因而在后續(xù)的透明化液清洗過程中可以減少蛋白的丟失；(2)組織凝膠復(fù)合物是帶有不同大小孔徑的，熒光染料可以通過小孔進(jìn)入組織內(nèi)部，與目標(biāo)蛋白結(jié)合，因此能夠標(biāo)記較厚的組織，克服傳統(tǒng)免疫熒光的缺點(diǎn)。形成組織凝膠復(fù)合物后，再通過透明化液清洗組織，除去脂質(zhì)和內(nèi)源性生色基團(tuán)，從而極大的提高組織的光透過度，通過對(duì)透明組織孵育抗體及熒光染料、共聚焦成像及3D重構(gòu)，得到完整組織結(jié)構(gòu)單細(xì)胞分辨率水平的可視化信息。