[發明專利]一種基于4Pi顯微鏡架構的顯微鏡頭與樣品鎖定系統

有效

• 申請號: 201610546464.1
• 申請日: 2016-07-08
• 公開（公告）號: CN105954862B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 李旸暉;周輝;來鄰;夏浩盛;王樂
• 申請（專利權）人: 中國計量大學
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G02B21/18;G02B21/36
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 黃燕

技術領域

本發明涉及光學儀器領域、生物醫學顯微成像領域，具體涉及一種基于4Pi顯微鏡架構的顯微鏡頭與樣品鎖定系統。

背景技術

目前在生物醫藥領域的研究對分辨率的要求越來越高，研究人員需要了解各種亞百納米尺度上微小形態物質的三維結構信息，然而傳統光學顯微鏡無法達到這樣的分辨率，特別是在光軸方向上的分辨能力遠遠不足。電鏡和原子力顯微鏡雖然可以提供更高的分辨率，但是只能局限于提供表面圖像，無法對深層組織和活細胞進行成像，而4Pi共聚焦系統的出現完美地解決了這個問題。根據瑞利數據，增加物鏡的數值孔徑，可以減小點擴散函數的尺寸，從而提高顯微鏡的分辨率。4Pi顯微鏡正基于此原理，利用通過樣品前后的雙物鏡，使顯微鏡總的立體接收角接近4Pi，從而提高數值孔徑，提高顯微鏡分辨率特別是軸向分辨率。通常4Pi顯微鏡基于寬場或共聚焦顯微鏡平臺，采用兩個相對的相同物鏡，可將軸向分辨率大幅提升，獲得極佳的三維效果，因此在亞細胞結構、細胞內寄生蟲和病毒等的觀察方面具有廣泛的應用。

對于顯微鏡而言，必須保證其工作的時候，物鏡聚焦于樣品表面。作為一套自動化儀器，具備焦平面鎖定功能的顯微鏡，可以很好的保證系統的位相關系，為顯微鏡使用者獲得高質量圖片提供極大的便利。作為一種干涉系統，在4Pi架構的顯微系統中，必須同時保證兩個相對的物鏡均聚焦在樣品上相同位置。因此，兩個顯微鏡頭與樣品相對位置鎖定系統對于4Pi架構的顯微系統而言顯得更為關鍵。而與一般單鏡頭相比，4Pi架構的顯微系統對于機械振動、熱膨脹等因素更為敏感，焦平面鎖定功能是一般4Pi架構顯微系統的必要組成部分。 Roman Schmidt等人在《自然》雜志中發表的題為《Spherical nanosized focal spot unravels the interior of cells》的論文中，應用了經典4Pi架構的顯微系統，采用兩套獨立的鎖定系統分別鎖定兩個鏡頭與樣品間的相對位置。這種設計可以充分借鑒單鏡頭顯微系統的已有成果，提高設計效率，但是，該種設計方案的最大問題在于：無法保證兩個鏡頭間相對位置的穩定。當鏡頭位置偏移量較大(橫向偏移大于100納米，軸向大于300納米)時，可以在系統圖像中觀察到“重影”現象。這種重影現象原理上可以通過后期圖像處理算法，如自相關算法等加以矯正。但在現實中，由于上下鏡頭單獨成像圖像不可避免存在微小差異，后期圖像處理本身即有可能導致圖像失真等嚴重問題。對于基于4Pi架構的超分辨顯微系統，如4Pi單分子定位顯微系統(4Pi-SMS)而言，由于其自身設計分辨率較高(<50納米)，并且在原理上依賴熒光干涉實現對于單分子的定位，對于鏡頭位置的相對偏移的容忍度更低(橫向偏移小于20納米，軸向小于50納米)。因此，現有的鎖定系統設計并不能滿足4Pi顯微架構顯微鏡的需要。

發明內容

本發明針對現有4Pi顯微系統中無法保證兩個鏡頭相對位置、精度較低，以及后期圖片處理易失真等諸多問題，提出了一種新型的基于4Pi架構的顯微鏡頭與樣品鎖定系統。該結構高效、精確，可以同時實現對4Pi顯微鏡系統中雙鏡頭相對位置的實時調節。

一種基于4Pi顯微鏡架構的顯微鏡頭與樣品鎖定系統，包括激光器、第一透鏡、第一偏振分束鏡、第二偏振分束鏡、第一二色鏡、上顯微鏡頭、樣品臺、下顯微鏡頭、第二二色鏡、第二透鏡、柱面鏡、第一CMOS照相機、偏心孔徑光闌、第一反射鏡、第三透鏡、第二反射鏡、第二CMOS照相機；

所述激光器發射的光束經過第一透鏡的擴束準直后，發射至第一偏振分束鏡：

光束中垂直偏振分量繼續沿原方向傳輸，經過第二偏振分束鏡出 射后被第一二色鏡反射進入上顯微鏡頭，被上顯微鏡頭匯聚到樣品面；從樣品下表面出射后，被下顯微鏡頭收集，之后被第二二色鏡反射，經過第二透鏡、柱面鏡后被第一CMOS相機收集并成像；

光束中水平偏振分量被反射，經過偏心孔徑光闌后，形成細光束，之后被第一反射鏡反射，經第三透鏡會聚到第二反射鏡表面，第二反射鏡反射后，進入第二偏振分束鏡后再次被反射至第一二色鏡表面；經過第一二色鏡反射后，進入上顯微鏡頭，會聚入射在樣品表面，然后由于入射角較大，被樣品表面反射回上顯微鏡頭，再次經過第一二色鏡后，被第二偏振分束鏡反射到第二反射鏡表面；之后通過第三透鏡形成平行光束，被第二CMOS相機收集并成像；