[發明專利]一種檢測galectin?4的熒光酶聯免疫分析方法

有效

• 申請號: 201610539941.1
• 申請日: 2016-07-11
• 公開（公告）號: CN106248951B
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 劉景豐;曾永毅;劉小龍;張曉龍;鄭愛仙;廖乃順
• 申請（專利權）人: 福州市傳染病醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/532;G01N21/64
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司33246
• 代理人: 冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種檢測galectin-4的熒光酶聯免疫分析方法。

(二)背景技術

Galectin-4(半乳糖凝集素-4)是β-半乳糖苷結合蛋白，屬凝集素家族成員，它具有CRD結構域，與含β-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂具有很高的親和力，在細胞與細胞、細胞與基質之間起到特異性粘附作用，與腫瘤的轉移、浸潤、生長和粘附密切相關。研究表明，galectin-4的異常表達與某些癌癥有關，例如，在某些發生轉移的結腸癌、乳腺癌患者血清中的galectin-4含量顯著提高；另外，在胰腺癌、肝細胞癌、胃癌患者中galectin-4含量也是上調的。因為galectin-4在癌細胞轉移、生長等方面的重要功能，其有望成為重要的靶標分子用于診斷和治療，所以開發靈敏的選擇的檢測galectin-4的方法具有重要應用價值。

酶聯免疫分析方法是最為常用的一種免疫分析方法，為了達到更好的檢測靈敏度，通過納米材料載體來提高酶與檢測抗體的比率是一種常用且有效的方法。目前，已有許多納米材料如金納米材料、碳納米管、石墨烯納米片、脂質體等材料被用做酶與抗體的載體。但是，這些固定方法有些存在長時間的、共價的修飾或者復雜的組裝過程、所用載體成本高等不足，限制了這些方法的應用。所以，開發一種簡單、低成本、高效的酶固定方法，有很大應用價值的。

(三)發明內容

本發明目的是基于簡單、低成本、高效的酶固定方法，提供一種合成簡單、成本低、靈敏度和穩定性高的檢測galectin-4的熒光酶聯免疫分析方法。

一種檢測galectin-4的熒光酶聯免疫分析方法，所述方法包括：

(1)合成熒光金納米簇；

(2)固定葡萄糖氧化酶：先合成葡萄糖氧化酶-金屬有機框架復合物GOx/ZIF-8，然后在GOx/ZIF-8外層包裹聚多巴胺殼層得到GOx/ZIF-8-PDA，再修飾上鏈霉親和素得到GOx/ZIF-8-PDA-STV；

(3)目標蛋白檢測：

i.酶標板以包被稀釋液包被目標蛋白，孵育后，再以洗滌液洗板；

ii.加入封閉液進行封閉，再以洗滌液洗板；

iii.加入生物素標記抗體孵育形成抗原-檢測抗體特異反應，再以洗滌液洗板；

iv.再加入步驟(2)所得GOx/ZIF-8-PDA-STV孵育，利用鏈霉親和素與生物素特異結合將酶復合物鏈接至抗體上，再以洗滌液洗板；

v.加入1～100mM的葡萄糖溶液孵育反應，20～37℃反應5～60分鐘，生成過氧化氫；

vi.將反應液轉移至離心管；

(4)在離心管中，分別加入硫酸亞鐵溶液和步驟(1)合成的熒光金納米簇，用熒光光譜儀分別檢測溶液熒光值；

(5)梯度濃度的Galectin-4蛋白標準品按照步驟(3)、(4)方法進行檢測，處理步驟(4)所得數據，繪制標準曲線；

(6)根據待測蛋白樣品的檢測結果，對照標準曲線，獲得待測蛋白樣品的濃度數據。

所述步驟(2)方法如下：將醋酸鋅溶液或者硝酸鋅溶液或者氯化鋅溶液中的一種或者幾種二價鋅離子混合溶液與2-甲基咪唑溶液混合，鋅離子與2-甲基咪唑溶液的摩爾濃度比為10:1～1:10，再加入葡萄糖氧化酶溶液至葡萄糖氧化酶濃度為0.1～10mg/mL，反應30分鐘后，離心洗滌收集得GOx/ZIF-8；將GOx/ZIF-8分散于濃度5～50mM的Tris-HCl緩沖液中加入多巴胺溶液至多巴胺終濃度為0.05～10mg/mL，進行自聚合反應10分鐘～12小時，離心洗滌收集得GOx/ZIF-8-PDA；將GOx/ZIF-8-PDA與STV溶液于pH 8.0～8.5緩沖液中，STV終濃度為1μg/mL～1mg/mL，共價反應10分鐘～12小時，離心洗滌收集得GOx/ZIF-8-PDA-STV。

所述熒光金納米團簇是以谷胱甘肽為還原劑和保護劑還原氯金酸溶液得到；所述熒光金納米團簇激發波長為375nm，發射波長為500～700nm，發射峰為610nm。

所述包被稀釋液為10mM、pH 7.4的PBS；所述洗滌液組成如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.05％Tween-20，溶劑為50mM、pH 7.4的PBS；所述封閉液為1％BSA，溶劑為前述洗滌液。