[發明專利]一種基于鯉魚上皮瘤細胞EPC的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法

有效

• 申請號: 201610536389.0
• 申請日: 2016-07-08
• 公開（公告）號: CN105950571B
• 公開（公告）日: 2019-08-23
• 發明（設計）人: 周偉東;鄧平;喻運珍;喻婷;張立強;周勇;徐洪亮;艾桃山;林蠡;周裕和
• 申請（專利權）人: 武漢市農業科學院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇;徐曉琴

1.一種基于鯉魚上皮瘤細胞EPC的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）EPC細胞的培養：將EPC細胞接種于培養基中，培養至細胞長成單層，細胞數量>10⁶/mL；

（2）ISKNV毒種的制備：取EPC細胞，向其中加入含ISKNV病毒和2%胎牛血清的感染液，恒溫培養后，收集培養液上清；所述恒溫培養的溫度為25℃，時間為8~12天；

（3）ISKNV毒種的復壯：另取EPC細胞，向其中加入收集的培養液上清，用培養液上清中的ISKNV病毒感染EPC細胞，恒溫培養后，再次收集培養液上清；重復此步驟2~3次；所述恒溫培養的溫度為25℃，時間為8~12天；

（4）ISKNV毒種經多次復壯后，取培養液上清液氮保存，作為ISKNV病毒擴增毒種；

（5）利用ISKNV病毒擴增毒種感染EPC細胞，恒溫培養至細胞裂解比例>80%，收集上清液，ISKNV病毒粒子即存在于所述上清液中；所述恒溫培養的溫度為25℃，時間為5~6天。

2.根據權利要求1所述的基于鯉魚上皮瘤細胞EPC的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步驟（1）所述培養基為含10%胎牛血清的M199培養基。

3.根據權利要求1所述的基于鯉魚上皮瘤細胞EPC的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步驟（1）中EPC細胞的培養時間為2~3天。

4.根據權利要求1所述的基于鯉魚上皮瘤細胞EPC的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步驟（2）中所述感染液為含有ISKNV病毒和2%胎牛血清的M199培養基。

5.根據權利要求1所述的基于鯉魚上皮瘤細胞EPC的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，對步驟（5）收集的上清液進一步離心后取上清液，所述上清液中ISKNV病毒粒子的含量>10⁹/mL。

6.根據權利要求5所述的基于鯉魚上皮瘤細胞EPC的鱖魚傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，所述離心的轉速為12000rpm。