[發明專利]適用于H7N9禽流感病毒實時熒光定量PCR檢測的質粒標準物質

在審

• 申請號: 201610522919.6
• 申請日: 2016-07-05
• 公開（公告）號: CN107586776A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 許麗;劉剛;梁文;李妍;李蘭英;聞艷麗
• 申請（專利權）人: 上海市計量測試技術研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/44;C12Q1/70;C12Q1/6851;G01N27/64;G01N21/33;C12R1/93
• 代理公司: 上海弼興律師事務所31283
• 代理人: 薛琦,沈利

技術領域

本發明涉及一種生物工程技術領域的質粒分子，具體涉及一種適用于H7N9禽流感病毒實時熒光定量PCR檢測的質粒DNA標準物質及其構建方法、定量方法和應用。

背景技術

H7N9禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)首先于2013年3月在我國上海、安徽發現3例，經國家衛生和計劃生育委員會確認通報為全球首次發現的感染人的新型禽流感病毒株。隨后在我國上海、安徽、江蘇、浙江、北京、河南、山東、江西、福建和臺灣等地區均出現散發的確診病例。H7N9病毒感染者常出現嚴重的肺炎和急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，甚至多器官功能障礙，病死率高。目前確診的人數已經達到200多例，其中死亡超過60人。以現有病例數和死亡數字計算，H7N9的病死率達到20％至30％。人感染H7N9禽流感病例的出現受到了世界許多國家以及世界衛生組織(WHO)的關注。因此，H7N9禽流感病毒檢測方法及抗病毒藥物的研究是當前各國科學家和醫藥工作者研究的一個關注的重點。

當前針對H7N9禽流感等動物傳染病的診斷方法主要有病原學方法、血清學方法和分子生物學方法。病原學診斷方法準確但診斷時間較長，達不到快速檢測的需求，同時要求被檢測樣品有較好的新鮮度；血清學診斷方法的特異性和準確度存在一定的局限性；實時熒光反轉錄PCR方法(real-time reverse-transcription PCR,real-time RT-PCR)是分子生物學檢測方法之一，直接檢測病原體RNA，具有快速、特異性強且不受樣品新鮮度限制的優點，且較常規PCR靈敏度更高、少污染、操作更便捷、反應更快速，可以為疾病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間，因此已經成為H7N9禽流感病毒檢測的重要方法。目前已有較多文獻報道使用實時熒光RT-PCR方法檢測H7N9病毒，也有相應的試劑盒研制成功并投放市場。

然而在實際的實時熒光RT-PCR方法檢測過程中，RNA抽提失敗、反轉錄效率低、PCR體系中存在抑制劑等因素容易造成假陰性結果，因此有必要研究具有明確量值溯源性的標準物質，形成完善的參考系統，開展試驗室間質評，提高檢測水平。目前針對H7N9禽流感病毒實時熒光RT-PCR檢測方法，仍然沒有有證標準物質(Certified Reference Material,CRM)，各檢測單位在檢測時常采用病毒陽性樣本、提取的病毒RNA、非感染性體外轉錄RNA、自行研制的質粒DNA分子或試劑盒自帶的陽性標準品作為質控品，穩定性差、存在安全隱患、陽性樣品難以獲取且缺乏統一的定值方法，造成各實驗室之間的檢測結果差異大，缺乏可比性、有效性和可靠性。

目前針對H7N9禽流感病毒，WHO采用由英國國家生物標準與檢定所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)研制的一種重組禽流感毒株標準品。這類標準品接近于禽流感病毒，但是存在溯源性限制，價格昂貴，數量較少，并且由于其是病毒，穩定性差，存在一定風險，對運輸條件要求較高，較難運輸。因此這類標準品不能完全滿足各國禽流感病毒臨床檢驗實驗室質量控制的需求，也不能滿足H7N9檢測試劑方法標準化、性能評價的需求，急需研制新型H7N9禽流感病毒檢測標準物質。

質粒DNA標準物質是一種含有檢測目的基因的特異性片段的重組質粒分子，在PCR定性檢測中可以作為陽性對照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標準品，構建定量分析的標準曲線。質粒DNA標準物質的優點主要是可以通過微生物進行大量培養，DNA易于擴增，所以可提供無限量穩定的標準物質，并且純度較高；且操作容易，穩定性高，同一個質粒分子可以同時包含多個外源目的基因，經濟又高效。但是目前質粒DNA標準物質尤其是有證標準物質還是很少，這也是全世界生物計量領域研究的熱點，如美國的國家標準技術研究院(NIST)、英國政府化學家實驗室(LGC)和歐盟委員會聯合研究中心標準物質與測量研究院(IRMM)等研究機構都投入了很大科研力量進行相關標準物質的研發，成果主要集中于轉基因檢測領域質粒DNA分子標準物質，但是針對病毒檢測用的質粒DNA標準物質還是空白。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的重組禽流感毒株標準品價格昂貴、數量少、不能滿足禽流感病毒臨床檢驗實驗室質量控制的需求，也不能滿足H7N9檢測試劑方法標準化、性能評價的需求的問題，提供了一種適用于H7N9禽流感病毒實時熒光定量PCR檢測的質粒標準物質及其構建方法、定量方法和應用。