[發明專利]檢測前列腺特異抗原與α1?抗糜蛋白酶復合物的試劑盒

有效

• 申請號: 201610502331.4
• 申請日: 2016-06-29
• 公開（公告）號: CN106198989B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 周澤奇;劉春龍;翟栓柱;李寧;粟艷
• 申請（專利權）人: 丹娜（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/12
• 分類號: C12N5/12
• 代理公司: 天津欣達睿誠知識產權代理事務所(普通合伙)12216
• 代理人: 李欣

技術領域

本發明涉及一種檢測前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復合物(PSA-ACT)的試劑盒，尤其是指一種新的定量檢測病人血清中前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復合物的試劑盒及其制備方法和應用，屬于診斷試劑和醫療器械領域。

背景技術

前列腺疾病是中老年男性健康的一大威脅。在發達國家中，前列腺癌(prostate cancer)的發病率很高，死亡率居第二位。據美國2012年和2013年的統計表明，大約有50萬例新發病例，其中死亡率達到了10％。總體來說，發達國家前列腺癌的發病率在15％左右，遠高于發展中國家。但是，中國作為發展中國家，近年來前列腺癌發病率呈上升趨勢。由于前列腺癌在早期癥狀不明顯，因此很難被發現。前列腺癌的患者主要是老年男性，隨著我國人口老齡化越來越嚴重，患病人數會持續升高。

目前國際上普遍使用的診斷前列腺癌的方式是檢測血液中總前列腺特異性抗原濃度。上世紀70年代，分別從人精漿和前列腺上皮細胞中分離出一種糖蛋白，發現其具有前列腺特異性，因此將其命名為前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)。進入血循環的大部分前列腺特異性抗原迅速與蛋白水解酶抑制物結合，主要有3種形式存在，(1)與α-1抗糜蛋白酶(ACT)結合，占70％-90％，稱為結合PSA(CPSA)；(2)與α-2巨球蛋白結合(MG)，目前無法檢測到；(3)一部分被蛋白水解酶滅活后以游離狀態存在，無免疫活性，占10％-30％，稱為游離PSA(FPSA)。

對于健康男性，釋放入血中的PSA濃度很低，為＜4ng/ml。但是，在前列腺癌病人血清中，PSA會同現另外的組合形式，比如PSA與蛋白C抑制劑的組合等。PSA作為前列腺癌的特異性標志物，對前腺癌的診斷特異性達90％-97％。被認為是有價值的前列腺癌的腫瘤標志物，被廣泛應用于前列腺癌的篩選、診斷及治療后的監測等。PSA在血清中主要有兩種存在形式：一種是游離型的PSA(F-PSA)，另一種是與α1-抗糜蛋白酶(ACT)結合的PSA(PSA-ACT)，約占血清PSA總濃度的70％～90％。因此，特異性檢測前列腺病人血清中的PSA-ACT濃度對于前列腺癌的篩選、診斷及治療后的監測等具有十分重要的意義。

現有技術中的PSA-ACT抗原是前列腺特異抗原(PSA)和α-1抗糜蛋白酶(ACT)的復合物，其中，PSA是一種含有237個氨基酸的單鏈多肽，屬于具有組織特異性的有糜蛋白酶樣作用的絲氨酸蛋白酶族，而ACT是一種可以在多種腫瘤類型中表達的絲氨酸蛋白酶抑制劑，雖然它的生物和臨床特性還不完全清楚，但是它的表達和腫瘤的生長及預后有關。由于PSA-ACT的免疫原性較為復雜，結合位點較多，不易獲得能同時結合PSA和ACT的雙特異性的抗體。目前尚未有檢測前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復合物的試劑。

發明內容

本發明要解決的主要技術問題是提供一種檢測前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復合物(PSA-ACT)的定量檢測試劑盒、其制備方法及應用。

本發明要解決的另一個技術問題是提供抗一株穩定表達抗前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶的偶聯抗原的單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種前列腺特異抗原與α1-抗糜蛋白酶復合物定量檢測試劑盒，包括抗PSA-ACT單克隆抗體包被的酶標板和抗PSA-ACT酶標抗體。

所述抗PSA-ACT單克隆抗體和抗PSA-ACT酶標抗體為PSA-ACT合成抗原的抗體。

現有技術中，PSA-ACT的免疫原性較為復雜，結合位點較多，不易獲得能同時結合PSA和ACT的雙特異性的抗體。本發明首先對現有技術中的PSA-ACT抗原進行了修飾與偶聯，通過加入一定量的蛋白質水解酶使其斷裂成若干肽段，將這些肽段分別與牛血清白蛋白(BSA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、G球蛋白和微球等載體偶聯，增加半抗原的相對分子質量，提高其本身的結構特異性和免疫原性，誘導機體產生免疫應答反應。通過大量的實驗進行篩選，得到具有優異免疫原性的PSA-ACT偶聯抗原，在此基礎上制得了表達針對PSA-ACT的兩端點的具有高特異性的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

所述PSA-ACT合成抗原由前列腺特異抗原片段和α1-抗糜蛋白酶片段通過偶聯載體連接組成，前列腺特異抗原片段具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，α1-抗糜蛋白酶片段具有序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

其中前列腺特異抗原(PSA)片段氨基酸序列如下：