[發明專利]芽胞@Zr4+

有效

• 申請號: 201610497713.2
• 申請日: 2016-06-30
• 公開（公告）號: CN107942053B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 胡涌剛;夏苗苗;李政
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/531
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種芽孢@Zr⁴⁺功能微球在制備免疫診斷試劑中的應用，其特征在于，所述的應用方法包括：

(1)芽孢桿菌的培養及芽孢的收集：分別取用50％甘油保存在–20℃的解淀粉芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌菌種200μL，加入滅菌的5mL LB液體培養基中，置37℃控溫搖床中于180rpm培養過夜，使菌種活化；當OD₆₀₀＝0.6時，吸取200μL加入到已冷卻的LB固體培養基平板上，用玻璃棒涂布均勻后，收集培養7天的芽孢，用去離子水洗滌并離心，重復4–5次；

(2)芽孢處理：將收集到的解淀粉芽孢桿菌的芽孢、巨大芽孢桿菌的芽孢用雙蒸水重懸后，在冰浴條件下，用超聲波破碎儀每次超聲5min，超聲間隔5min使芽孢液冷卻，超聲輸出強度為7–8，頻率為20％–30％，超聲20min后離心洗滌3-4次；收集沉淀下來的芽孢，用15–20mL的1％胰蛋白酶溶液重懸，在37℃搖床中于80rpm振蕩過夜；離心去除胰蛋白酶溶液，加入15–20mL的去衣被劑(Decoating Buffer)，在70℃的條件下磁力攪拌反應2h；將處理好的芽孢離心去除上清液，用雙蒸水清洗芽孢5次，再將芽孢重懸后，取少量用于芽孢計數，剩余的在121℃高壓滅活30min，使芽孢失去活性，即為芽孢儲備液，置4℃下保存備用；

(3)芽孢吸附鋯離子：取1mL處理好的芽孢儲備液置于EP管中，12000rpm離心2min，棄掉上清，加入1mL 0.5mol/L的Zr⁴⁺離子溶液將芽孢重懸，吹打均勻使芽孢充分分散，將EP管放入搖床中于100rpm振蕩1h，離心去上清，用雙蒸水洗滌三次，保存在4℃冰箱中備用；

其中：

步驟(2)中所述的去衣被劑(Decoating Buffer)的配方如下：分別稱取0.40g的氫氧化鈉，5.84×10^-1g的氯化鈉，1.00g的十二烷基硫酸鈉，1.54g的二硫代蘇糖醇，加超純水定容至100mL；

1％胰蛋白酶溶液的配方如下：稱取1g胰蛋白酶，溶于100mLpH7.4的PBS緩沖液中；

步驟(3)中所述的0.5mol/L的Zr⁴⁺溶液配制方法：稱取8.056g的八水氧氯化鋯溶于50mL去離子水中；

步驟(2)中所述的芽孢桿菌是保藏編號為CCTCC AB 92052的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和保藏編號為CCTCC AB 2013062的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；

所述的Zr⁴⁺離子來源于八水氧氯化鋯(ZrOCl₂·8H₂O)，分子量為322.25。