[發明專利]一種產松柏醇的工程菌、構建方法及產松柏醇的用途

有效

• 申請號: 201610470876.1
• 申請日: 2016-06-20
• 公開（公告）號: CN107523582B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 趙廣榮;劉津;馬雅婷
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了一種產松柏醇的工程菌、構建方法及產松柏醇的用途，構建方法：全化學合成TAL、COMT、4CL和CCR基因；PCR克隆hpaBC、yahK、metK和pntAB基因；全化學合成pBPE001、pBPE002、pBPE003；將基因TAL、hpaBC、COMT與pBPE001連接，得到pTHM；將基因4CL、CCR、yahK與pBPE002連接，得到pLRH；將基因pntAB、metK與pBPE003連接，得到pNAM；將T7RNA聚合酶基因整合到SyBE?002447底盤菌株，得到SyBE?002447(DE3)菌株；將pTHM、pLRH和pNAM轉化到SyBE?002447(DE3)，得到工程菌SyBE?CNF。以葡萄糖為碳源，進行發酵生產松柏醇。本發明使用工程大腸桿菌生產松柏醇，可解決松柏醇的來源問題，降低成本。

技術領域

本發明所屬生物醫藥技術領域，涉及一種產松柏醇的工程菌、構建方法及產松柏醇的用途。

背景技術

松柏醇(Coniferyl alcohol)，分子式是C₁₀H₁₂O₃，分子量為180.20，片狀晶體，易溶于乙醚，溶于乙醇，不溶于水。松柏醇作為重要醫藥中間體，在醫藥上用作合成抗癌藥物鬼臼毒素和抗肝炎藥物水飛薊賓的重要中間體。

目前對松柏醇的合成主要有以下三種方法。

(1)以乙酰阿魏酸為原料，制得酰氯后，再酯化，最后還原得到松柏醇，但其總收率僅24.4％；(2)以阿魏酸為原料，經酯化，乙酰化，再經還原得到松伯醇，總收率70.2％；這兩種方法都需要用到氫化鋁鋰還原，收率欠佳，且操作不便；(3)以香草醛為原料，與丙二酸縮合后得到阿魏酸，經酯化和乙?；蟮靡阴０⑽核嵋阴?，再用硼氫化鋰還原后得到松伯醇，總收率可達73.6％，改進后的路線原料易得，反應條件溫和，收率提高，成本降低，為松柏醇的大量制備提供了可能。

但是，上述有機合成原料與生產工藝存在環境污染，不符合綠色環保可持續發展的要求。近年來，隨著合成生物技術的不斷進步，使用工程微生物生產化學品逐漸成為備受關注的方法。但目前為止還沒有任何文獻報道利用工程微生物合成松柏醇。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供產松柏醇的工程菌。

本發明的第二個目的是提供產松柏醇的工程菌發酵制備松柏醇的方法。

本發明的第三個目的是提高工程菌產松柏醇產量的方法。

本發明的技術方案概述如下：

產松柏醇的工程菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)化學合成TAL、COMT、4CL和CCR基因，所述基因TAL、COMT、4CL和CCR的核苷酸序列依次用SEQ ID No.05，SEQ ID No.06，SEQ ID No.07，SEQ ID No.08所示；

(2)PCR克隆hpaBC、yahK、metK和pntAB基因；所述基因hpaBC、yahK、metK、pntAB的核苷酸序列依次用SEQ ID No.01，SEQ ID No.02，SEQ ID No.03，SEQ ID No.04所示；

(3)全化學合成以SEQ ID No.09所示的表達載體骨架pBPE001、以SEQ ID No.10所示的表達載體骨架pBPE002、以SEQ ID No.11所示的表達載體骨架pBPE003；

(4)將所述基因TAL、hpaBC、COMT與表達載體骨架pBPE001通過酶切連接方式進行連接，得到重組表達載體pTHM；將所述基因4CL、CCR、yahK與表達載體骨架pBPE002 通過酶切連接方式進行連接，得到重組表達載體pLRH；將所述基因pntAB、metK與表達載體骨架pBPE003通過酶切連接的方式進行連接，得到重組表達載體pNAM；