[發明專利]一種檢測癌細胞內溶酶體pH的熒光探針

有效

• 申請號: 201610466181.6
• 申請日: 2016-06-24
• 公開（公告）號: CN106117241B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 林偉英;董寶利;宋學真;孔秀琪;王超
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C07D495/04
• 分類號: C07D495/04;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所37218
• 代理人: 張世靜

技術領域

本發明涉及一種用于癌細胞內溶酶體pH成像的新型比率型熒光探針及其應用，屬于分析化學技術領域。

背景技術

細胞內pH值作為新陳代謝的一個重要的參數，在細胞周期調控、細胞的z增值與凋亡、離子轉運、酶活性、鈣調控、肌肉收縮等細胞生理調控和病理過程中發揮著非常重要的作用。同時，細胞的內吞作用以及受體配體的內化作用也同樣受細胞內pH的影響。細胞內pH異常會導致生物體內細胞和組織器官的生理功能紊亂、酶和蛋白質活性受到抑制、人體的免疫力下降，最終引發炎癥、癌癥以及阿爾茨海默癥等疾病。研究表明，在細胞凋亡初期，癌細胞通常會產生起細胞內的酸化作用，因此細胞內酸化已成為細胞凋亡的一個重要的早期特征。此外，細胞內 pH變化同時與細胞凋亡密切相關。因此，對細胞內 pH進行準確地進行原位實時監測，有助于從細胞水平上研究細胞的生理和病理過程。

溶酶體(lysosomes)是真核細胞中的一種細胞器，通常具有單層膜包被的囊狀結構，多為球形，大小約0.025~0.8微米。溶酶體內含蛋白酶、核酸酶、脂肪酶及硫酸脂酶等許多酶，為細胞內的消化器官，可分解各種蛋白質等大分子物質，具有溶解或消化的功能。溶酶體內的降解酶在弱酸性條件下（pH約為5）發揮最佳活性，但是當溶酶體內的pH異常時，由于各種降解酶的活性發生變化，其溶解消化功能會受到不同程度的影響，進而導致類風濕關節炎、腫瘤等疾病的發生。因此，迅速準確地檢測細胞內溶酶體的pH值可為研究相關生理和病理過程，以及預防關節炎、癌癥等相關疾病提供重要的信息。

熒光成像分析法具有靈敏度高、選擇性好、響應迅速、操作簡單等優點，而且對細胞基本沒有損傷，已經廣泛用于各種生物小分子的檢測。目前，用于檢測細胞內pH值的熒光探針也得到了迅速發展，其中一些已經商品化。但是，目前報道的和已經商品化的溶酶體pH熒光探針大都不具備溶酶體靶向，一般對所有細胞都有相應。因此開發新的具有高選擇性、高靈敏度、光穩定性及透膜性好，且具有癌細胞靶向的溶酶體pH熒光探針具有重要的意義。

發明內容

針對以上技術問題，本發明提供了一種新型檢測癌細胞內溶酶體pH的新型熒光探針及其應用。

本發明所述的新型檢測癌細胞內溶酶體pH的熒光探針為含有生物素基團的萘酰亞胺衍生物，其特征在于：所述熒光探針的化學結構通式如式（I）所示，其中生物素部分具有癌細胞靶向性：

式（I）

本發明所述檢測生物體系內次氯酸的熒光探針的制備方法為：將式（Ⅱ）所示的化合物a1 (1 mmol)、a2 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（2 mmol）、1-羥基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL)加入到50 mL單口燒瓶中，室溫攪拌16小時，過濾，烘干。將所得固體進行柱層析純化，得到淺黃色產物即為本發明所述檢測癌細胞內溶酶體pH的比率型熒光探針。

式（Ⅱ）

本發明所述的熒光探針在檢測癌細胞內溶酶體pH的應用。

本發明所述的熒光探針可應用于癌細胞內溶酶體pH的檢測評價。該探針作為癌細胞溶酶體pH的特異性探針，可在不同pH環境下，通過萘酰亞胺部分嗎啉基團的質子化，生成具有不同熒光發射能力的形態，通過檢測不同形態的熒光強度來測定癌細胞溶酶體中的pH。

具體測定方法為：室溫條件下，配制5 μM熒光探針乙醇溶液，加入到具有不同pH值的B-F緩沖液體系中，測定溶液熒光強度作為pH的評價指標。

本發明所述的熒光探針在酸性條件下，萘酰亞胺熒光團的嗎啉部分將會發生質子化，從嗎啉到萘酰亞胺熒光團的PET作用將被抑制，此時熒光探針可以發射萘酰亞胺熒光團的綠色熒光（峰值約為531 nm）；在堿性條件下，萘酰亞胺熒光探針的熒光因來自于嗎啉的PET作用而得到淬滅，此時萘酰亞胺熒光團的綠色熒光（峰值約為531 nm）將減弱。同時，由于生物素具有癌細胞靶向性，嗎啉具有溶酶體靶向功能，因此該熒光探針可以用于檢測癌細胞溶酶體內的pH。可采用熒光檢測器實現產物的快速靈敏檢測；檢測條件為：激發波長為380 nm，在420~700 nm之間進行熒光發射光譜的檢測。