[發(fā)明專利]一種酶及其編碼基因和它們的應(yīng)用以及制備人參皂苷化合物K的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610440705.4
• 申請(qǐng)日: 2016-06-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106011106B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓秀林;李銘剛;趙江源;黃開(kāi)心;楊勝江;馬鳳靈;包崇卯;林婷婷;張孝龍;文孟良;艾黎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南與諾生物工程有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;C12P33/20;C12P33/06;C12R1/84
• 代理公司: 北京潤(rùn)平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11283
• 代理人: 嚴(yán)政,劉兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種酶及其編碼基因和它們的應(yīng)用以及一種制備人參皂苷化合物K的方法。

背景技術(shù)

人參皂苷化合物K(人參皂苷Compound K，人參皂苷CK，結(jié)構(gòu)式如下式I所示)是二醇型人參皂苷(例如，人參皂苷Rb₃和絞股藍(lán)皂苷IX，結(jié)構(gòu)式分別如下式II和III所示)在人體腸道內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，屬于稀有人參皂苷。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷CK在體內(nèi)外都有良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，是一種潛在抗腫瘤藥物，并且在抗衰老、改善記憶、抗炎等各方面都有一定的療效。因此，如何獲得大量的人參皂苷CK是目前藥學(xué)研究的重點(diǎn)。

目前，人參皂苷CK主要通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法或生物合成法獲得。其中，生物轉(zhuǎn)化法是利用有機(jī)體(細(xì)胞、細(xì)胞器)或酶作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過(guò)程，是生物體系(包括細(xì)菌、真菌和植物組織等)對(duì)外源性底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的化學(xué)反應(yīng)。其本質(zhì)是利用生物本身所產(chǎn)生的酶對(duì)外源底物進(jìn)行的催化反應(yīng)。生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和、不易破壞皂苷結(jié)構(gòu)、副產(chǎn)物少、后處理簡(jiǎn)單及對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，以人參皂苷為原料進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化以獲得人參皂苷CK的研究越來(lái)越多，特別是利用微生物或酶對(duì)二醇型人參皂苷的C3和C20位的糖苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使含量較高的人參皂苷的糖苷經(jīng)過(guò)水解作用，定向轉(zhuǎn)化為人參皂苷CK。根據(jù)構(gòu)成糖苷結(jié)構(gòu)的糖基的不同，人參皂苷中常見(jiàn)的糖苷結(jié)構(gòu)包括葡萄糖苷、木糖苷、乳糖苷、阿拉伯糖苷等。但是，現(xiàn)有的用于人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的酶大部分具有高度專一性，即僅可以特異性作用于某一種糖苷結(jié)構(gòu)，而無(wú)法滿足同時(shí)作用于一種以上糖苷結(jié)構(gòu)的要求，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較低。因此，急需研發(fā)可以同時(shí)作用于一種以上糖苷結(jié)構(gòu)的酶，以提高生成人參皂苷CK的生物轉(zhuǎn)化率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新型的具有木糖苷酶和/或葡萄糖苷酶雙功能的酶及其編碼基因和它們的應(yīng)用以及制備人參皂苷化合物K的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種酶，其中，該酶為(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列組成的酶；

(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且酶活性不變的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端連接有標(biāo)簽的氨基酸序列組成的酶。

第二方面，本發(fā)明提供了編碼第一方面所述酶的基因。

第三方面，本發(fā)明提供了含有第二方面所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

第四方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其中，該組合物含有第一方面所述的酶作為活性成分。

第五方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌，以及第四方面所述的組合物中的任意一項(xiàng)在降解糖苷類化合物中的應(yīng)用。

第六方面，本發(fā)明提供了一種制備人參皂苷化合物K的方法，該方法包括：在酶解條件下，將含有糖苷類化合物的原料與酶接觸，其中，所述酶由第一方面所述的酶和/或由第四方面所述的組合物提供。

通過(guò)上述技術(shù)方案，將本發(fā)明提供的酶用于降解人參皂苷Rb₃、絞股藍(lán)皂苷IX和三七葉總皂苷時(shí)，其可能能夠作用于人參皂苷Rb₃和絞股藍(lán)皂苷IX中C20位的木糖糖苷結(jié)構(gòu)，同時(shí)也可將其C3位的兩個(gè)葡萄糖水解下來(lái)，從而獲得人參皂苷CK，并且人參皂苷CK的轉(zhuǎn)化率在84％以上。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

附圖是用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1獲得的重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證結(jié)果，其中，1為DNA標(biāo)記物，2-5為重組質(zhì)粒；

圖2為本發(fā)明的實(shí)施例1獲得的重組酶SDS-PAGE電泳圖，其中，M為蛋白標(biāo)記物，1為粗酶液，2為純化的酶液；

圖3為本發(fā)明的實(shí)施例1中酶活力測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；