[發(fā)明專利]肺炎支原體熒光定量引物及探針、檢測(cè)方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610438682.3
• 申請(qǐng)日: 2016-06-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107513558A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳康美生物科技股份有限公司;北京康美天鴻生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市深佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)44285
• 代理人: 王仲凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及肺炎支原體熒光定量引物及探針、檢測(cè)方法及試劑盒。

背景技術(shù)

肺炎支原體(Mycopasma Pneumoniae，MP)是介于病毒和細(xì)菌之間的一種微生物，含DNA和RNA，沒(méi)有細(xì)胞壁。MP的全基因測(cè)序已經(jīng)完成，P1蛋白的附近，有兩個(gè)特異性重復(fù)序列(RepPM 2/3和RepMp 4)，可將MP分為兩型，一型是以M129為代表的Group 1，二型是以FH為代表的Group 2。編碼P1的P1基因位于M129型的180858-185741nt位，共4884個(gè)核苷酸，編碼1627個(gè)氨基酸，G+C含量為54％，遠(yuǎn)高于全基因序列的平均值40.1％。P1蛋白前體中的前59位氨基酸是一段前導(dǎo)肽，成熟的P1蛋白由1568個(gè)氨基酸組成。

肺炎支原體是引起社區(qū)獲得性肺炎的重要致病原。感染流行周期為4～7年，流行時(shí)發(fā)病增加3～5倍，可在任何年齡發(fā)生，但其下呼吸道感染主要發(fā)生在學(xué)齡兒童和年輕人，尤其以5～20歲更多見(jiàn)。肺炎支原體通過(guò)飛沫以氣溶膠微粒的形式傳播，傳染性較小，需要長(zhǎng)時(shí)間密切接觸才能發(fā)病，在家庭成員中易相互傳染，其潛伏期16～32d，潛伏期即具傳染性，癥狀出現(xiàn)1周內(nèi)呼吸道含菌量最高，至癥狀緩解數(shù)周仍具傳染性，患者痊愈后可在咽部存留1～5月。

支原體肺炎是一種非常嚴(yán)重的傳染性疾病，在肺炎中，支原體肺炎約15％～20％，并且導(dǎo)致多種并發(fā)癥，支原體肺炎是由肺炎支原體引起的急性肺部感染。肺炎支原體廣泛存在，無(wú)地區(qū)性差異，平時(shí)散發(fā)，支原體肺炎每4～5年又一次流行。發(fā)病季節(jié)不明顯，寒冷季節(jié)發(fā)病率較高，占住院肺炎的10％～20％，流行期間可占30％。肺炎支原體的感染可發(fā)生在不同年齡的小兒，在年長(zhǎng)兒多見(jiàn)，在新生兒中報(bào)道不多。肺炎支原體的感染率有逐年增多的趨勢(shì)，臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、哮喘、氣促、胸悶、胸痛及不同程度的發(fā)熱和驚厥等。

肺炎支原體感染也可導(dǎo)致一系列呼吸系統(tǒng)外疾病，可引起支原體血癥，直接侵犯?jìng)€(gè)系統(tǒng)、組織引起病變。國(guó)外報(bào)道，從肺炎支原體呼吸道感染的病例血液中直接分離出肺炎支原體，提示肺炎支原體可進(jìn)入血液，存在呼吸道以外的部位增殖的可能性。支原體感染引起的肺外并發(fā)癥常累及心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚及肝腎器官。

由于培養(yǎng)法的困難和血清學(xué)方法的滯后，需尋找更靈敏更快速的方法。近十年來(lái)，定量PCR檢測(cè)方法的建立提供了一種快速，可靠的呼吸道病原檢測(cè)方法。具有快速，靈敏，定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)。目前，已經(jīng)有運(yùn)用多重定量PCR方法同時(shí)檢測(cè)上述病原體的報(bào)道，多重定量PCR的應(yīng)用極大的提高檢測(cè)的效率，并且節(jié)省了樣本量。

PCR檢測(cè)MP的靶基因主要有16S rRNA、ATPase、P1cytadhesin、CARDS toxin、RepMP等，其中P1基因是廣泛用于試劑盒的靶基因。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近些年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種核酸檢測(cè)技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。因?yàn)閷?shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的檢測(cè)物為致病病原體基因核酸，所以能夠準(zhǔn)確檢測(cè)處于疾病各個(gè)時(shí)期的病原體。目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可以分為兩種：熒光探針和熒光染料。由于Taqman探針具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、對(duì)引物及試劑要求不高等優(yōu)點(diǎn)，使該類型的熒光探針常用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。為了實(shí)現(xiàn)將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于肺炎支原體的檢測(cè)，很有必要提供一種特異性高、準(zhǔn)確性高的肺炎支原體核酸檢測(cè)的引物和探針。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供肺炎支原體熒光定量引物及探針、檢測(cè)方法及試劑盒，本發(fā)明提供的引物及探針針對(duì)肺炎支原體P1蛋白基因設(shè)計(jì)，具有良好的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性和精密性。

肺炎支原體熒光定量檢測(cè)引物組，包括如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物。

本發(fā)明還提供了肺炎支原體熒光定量檢測(cè)探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明提供的肺炎支原體熒光定量檢測(cè)探針的3’端標(biāo)記有MGB淬滅基團(tuán)；5’端標(biāo)記有6-FAM發(fā)光基團(tuán)。