[發明專利]一種抗大腸桿菌細胞株及重組單鏈抗體及其制備方法

在審

• 申請號: 201610438557.2
• 申請日: 2016-06-20
• 公開（公告）號: CN107523551A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 王建華;管慶豐;滕達;王秀敏;毛若雨;王瀟
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;C12N15/13;C07K14/245
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物工程領域，尤其涉及一種抗大腸桿菌重組單鏈抗體及其制備方法，以及編碼該單鏈抗體的基因，含有該基因的載體和宿主細胞等。

背景技術

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)，又稱大腸埃希氏菌，是一種革蘭氏陰性細菌，廣泛存在于生物體內，包括植物、人及其它溫血動物體內。作為一種機會致病菌，大腸桿菌在健康腸道內通常不會危害宿主健康，但其仍具有引起腹瀉和腸道外疾病的能力，如溶血性尿道綜合征、腦膜炎及敗血癥等。根據其毒力因子、致病機理、致病性、臨床特征及流行病特征，將致病性大腸桿菌分為以下幾類，包括腸致病性大腸桿菌(Enteropathogenic E.coli，EPEC)、腸產毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli，ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(Enteroinvasive E.coli，EIEC)、腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing E.coli，STEC)、腸黏附性大腸桿菌(Enteroaggregative E.coli，EAEC)及彌散粘附性大腸桿菌(Diffuse adhering E.coli，DAEC)等。這些致病性大腸桿菌是引起人及大多數動物患大腸桿菌疾病的主要病原菌群。

1975年，Kohler與Mlstein將免疫后的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，制備出針對某一抗原決定簇的特異性單克隆抗體。由于單克隆抗體具有高度特異性，且理化性質均一，重復性強，不存在多克隆抗體親和力不穩定的問題，使其在生物醫學領域得到廣泛的應用。

單鏈可變區抗體(single chain fragment variable，scFV)最早由Huston等于1988年利用基因工程技術制備，即首先在DNA水平上將抗體分子的V_H與V_L之間用一段適當的寡核苷酸，拼接起來，使之在合適的表達體系中表達。scFv大幅度減少了抗體的鼠源成份，不會引起HAMA，且其相對分子質量約為28kDa，僅為原抗體的1/6，且無多糖修飾，卻也能較好地保留抗原結合位點。由于scFV沒有Fc片段，不與細胞表面的Fc受體結合，故可以較容易地穿過血管壁或組織屏障。由于scFV在體內的半壽期短(0.5～21h)，與抗原形成的復合物更易被清除，因此很適合用作為中和抗體，阻斷病毒或其他胞內毒性損傷機體。

發明內容

本發明旨在提供分泌抗大腸桿菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株及重組scFV及其制備方法。

為實現上述目的，本發明通過下述技術方案實現：

設計大腸桿菌OmpA外膜蛋白表位疫苗，免疫小鼠BABL/c，制備單克隆抗體，得到兩株特異性的細胞株C208；提取上述細胞株mRNA，擴增單鏈抗體可變區重鏈及輕鏈基因，經融合PCR技術擴增了小鼠抗大腸桿菌單鏈可變區抗體(scFV)基因序列，該序列如SEQ ID NO：1所示(長度為1041bp)，并將該序列scFV在畢赤酵母體內進行重組表達，該scFV的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示(長度為346aa)；

附圖說明

圖1為雜交瘤細胞株C208小鼠腹水對重組外膜蛋白OmpA和大腸桿菌親和力。A：腹水對免疫表位效價；B：腹水對OmpA蛋白及大腸桿菌CVCC1515效價

圖2為C208scFV構建圖。A：pPICZαA-C208scFV重組載體構建示意圖；B：C208scFV V_L、V_H擴增及連接。M：marker II；1-2：V_H；3-4：V_L；5-6：V_H+linker+V_L。

圖3為酵母X-33表達C208-scFV發酵液上清電泳。M：14-94kDa蛋白marker；1-9：不同X-33克隆子發酵液上清。

圖4為部分X-33克隆子發酵液上清對大腸桿菌CVCC1515效價。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。