[發明專利]一種腸桿菌新菌株、獲取方法及應用

在審

• 申請號: 201610432521.3
• 申請日: 2016-06-17
• 公開（公告）號: CN107446834A
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 劉占英;龐建;郝敏;李永麗;石雅麗;張永鋒;胡建華
• 申請（專利權）人: 內蒙古工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12P19/02;C12P1/04;C12N9/42;C12N9/24;C12R1/19
• 代理公司: 包頭市專利事務所15101
• 代理人: 張少華

1.一種腸桿菌新菌株，其特征是：在羧甲基纖維素-剛果紅培養基上菌落形成透明圈直徑比（D/d）為6～8，呈圓形、表面濕潤、光滑、乳白色且不透明、邊緣不整齊，質地均勻且呈扁平狀；細胞呈革蘭氏陰性桿狀；生理生化特性：該菌株在37～39℃范圍內，pH為7.0時生長狀態良好，能發酵甘油、半乳糖、硝酸鹽、甘露醇、衛矛醇、蛋白凍水、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、葡萄糖、七葉靈、阿拉伯糖、果糖、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、木糖、麥芽糖、山梨醇和水楊酸，不能發酵纖維二糖、棉籽糖、蔗糖、硫化氫、明膠、淀粉、尿素、西蒙氏檸檬酸鹽、苯丙氨酸，具有運動性，兼性厭氧。

2.根據權利要求1所述的腸桿菌新菌株，其特征是：所述腸桿菌新菌株命名為ZH-4，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名稱為，ZH-4，保藏號是CGMCC NO.12427，保藏日期為2016年5月10日。

3.一種根據權利要求1、2所述的腸桿菌新菌株的獲取方法，其特征是：包括以下步驟：

（1）取樣：直接從剛被屠宰牛的瘤胃中取出未完全消化的食糜，快速放入滅菌的保溫瓶中，裝滿，帶回實驗室并用勻漿機勻漿10 s，將附著在食糜上的菌株震動下來，再用紗布進行過濾，將濾液注入滅菌且去除O₂的西林瓶中，制成菌種；

（2）富集：配制1000 mL培養基A：NaHCO₃ 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH₂PO₄ 3.0 g、NH₄)₂SO₄ 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl₂?2H₂O 0.4 g、MgSO₄?7H₂O 0.58 g、無細胞瘤胃液 170mL、余量為蒸餾水；每30 mL培養基A分裝到一個100 mL西林瓶中，封口壓蓋，抽真空后，121 ℃高壓滅菌30 min；潔凈工作臺紫外殺菌30 min后，步驟1的菌種按照接種量15%接種于西林瓶中，置于37 ℃，180 r/min搖床中培養，培養期間觀測纖維素和濾紙的降解程度，連續傳代接種3次，淘汰不能利用纖維素和濾紙的菌株后，制成富集菌液；

（3）初篩：配制1000 mL培養基B：NaHCO₃ 10.0 g、蛋白胨 2 g、酵母提取粉 2.0 g、KH₂PO₄ 3.0 g、(NH₄)₂SO₄ 3.0 g、NaCl 6.0 g、CaCl₂?2H₂O 0.4 g、MgSO₄?7H₂O 0.58 g、瓊脂20.0 g、剛果紅0.4 g、羧甲基纖維素鈉5.0 g、無細胞瘤胃液 170mL、余量為蒸餾水；每5 ml培養基B分裝到Hungate滾管中，封口壓蓋，抽真空后，121℃高壓滅菌30 min；潔凈工作臺紫外殺菌30 min后，準備燒杯裝入50℃以上的熱水并將滾管中培養基完全浸沒在熱水中；將步驟2的富集菌液按照10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8體積比濃度用滅菌蒸餾水梯度稀釋，將稀釋后的富集菌液接種以5%的接種量接種于Hungate滾管中，每個濃度梯度3個平行樣，迅速滾管，確保培養基充分、平滑、均勻的鋪在管滾內壁，置于37 ℃搖床中，180 r/min 培養，并觀察菌落生長情況，記錄菌落生長時間并確定最適濃度梯度；

（4）復篩：挑取菌落密度分布均勻的滾管用作菌種分離純化，記錄菌落的特征，包括具有透明圈的菌落并計算透明圈直徑與菌落直徑的數值，該數值的大小可以反應其纖維素降解能力的大小，將挑取的單菌落接種到培養基A中培養，每組3個平行樣，將不接種菌種的對照組和實驗組同時放到37 ℃，180 r/min的培養箱中進行培養，觀測纖維素的減少量及濾紙條崩潰程度，選出纖維素減少量快或濾紙條崩潰程度高的菌落即為新菌株。

4.一種根據權利要求1、2所述的腸桿菌新菌株的應用，其特征是：用于木質纖維素的降解，用于葡萄糖、木糖、或葡萄糖和木糖混合物的分解，或用于內切葡聚糖苷酶、外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的制造。