[發明專利]一種核酸等溫自擴增方法

有效

• 申請號: 201610420179.5
• 申請日: 2016-06-13
• 公開（公告）號: CN107488656B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 陸欣華
• 申請（專利權）人: 陸欣華
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 姚姣陽

本發明提供了一種核酸等溫自擴增方法，所述方法通過在目標模板兩端添加合適的回文互補序列，自身自發形成莖環結構；及提供反應所需的試劑和條件進行自擴增，所述自擴增方法中不需要添加額外擴增引物；所述試劑包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶。通過PCR或者連接酶等方法，在DNA末端引入合適的回文互補序列后，可以不依賴于外源擴增引物進行擴增；擴增溫度恒定，不需要復雜的溫控設備，擴增快速；擴增產物是連續互補序列的長單鏈DNA，可以應用于特殊場合；擴增沒有GC偏好性。

技術領域

本發明涉及一種核酸等溫自擴增方法，屬于核酸擴增技術領域。

背景技術

近幾十年來，核酸擴增技術為分子生物研究和病原微生物檢測做出了革命性的貢獻。

等溫擴增技術(Isothermal Amplification Technology)是核酸體外擴增技術，其反應過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物來達到快速核酸擴增的目的。常見的等溫擴增技術有以下幾種:環介導核酸等溫擴增技術(LAMP)；滾環擴增技術RCA；單引物等溫擴增SPIA；依賴解旋酶的等溫擴增技術HAD；鏈替代擴增SDA；但現有的方法由于鏈置換活性的DNA聚合酶在引物存在的情況下，普遍容易產生非特異性擴增。

而在二代測序領域中，例如二代測序文庫建庫過程中，經常需要通過PCR擴增來富集樣本，但現有的方法中，由于PCR擴增效率受模版GC含量影響，容易導致擴增產物均一性不好，在影響覆蓋度的同時也會產生非特異性擴增產物。

發明內容

本發明的目的在于解決上述問題，提出一種核酸等溫自擴增的方法。

本發明的目的通過以下技術方案來實現：

一種核酸等溫自擴增方法，包括如下步驟，

a、在目標模板兩端添加所需序列的DNA接頭；

c、提供反應所需的試劑和條件；

所述所需序列的DNA接頭為具有自發形成自身莖環結構的線性核酸片段，所述自擴增方法中不需要添加額外擴增引物；

所述試劑包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶。

優選地，所述DNA聚合酶為Bst酶，或者其他DNA聚合酶。

優選地，所述目標模板兩端添加的DNA接頭為具有回文互補序列的線性核酸片段，能夠自發形成自身莖環結構，從而觸發DNA聚合酶進行延伸擴增。

優選地，所述擴增方法的產物為折疊互補單鏈DNA。

一種核酸等溫自擴增方法的應用，所述方法可用于二代測序文庫的建立，所述文庫建立方法通過將基因組DNA長鏈打斷成小片段，在片段兩端連接上含有適合序列的接頭，進行循環擴增；或者通過轉座子，crispr/cas9系統等選擇性的插入接頭片段，進行選擇性擴增。

本發明的有益效果主要體現在：

在等溫情況下，可以對目的片段快速有效擴增；

在DNA末端引入合適的回文互補序列后，可以不依賴于引物進行擴增；

擴增產物是連續互補序列的長單鏈DNA，可以應用于特殊場合。

擴增沒有GC偏好性。

附圖說明

下面結合附圖對本發明技術方案作進一步說明：

圖1：DNA雙鏈末端的呼吸機制和構象轉換過程示意圖。

圖2：DNA雙鏈末端(3’和5’端)均有適合自擴增序列的情況下，自擴增的過程示意圖。

圖3:在目的基因末端添加合適序列的過程示意圖。