[發明專利]一種小鼠滑膜細胞的分離及培養方法在審
| 申請號： | 201610415862.X | 申請日： | 2016-06-07 |
| 公開（公告）號： | CN107475179A | 公開（公告）日： | 2017-12-15 |
| 發明（設計）人： | 何剛;張亞洲;蔣敏;齊來俊 | 申請（專利權）人： | 江蘇齊氏生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 214434 江蘇省無錫市江陰市東*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 小鼠 細胞 分離 培養 方法 | ||
1.一種小鼠滑膜細胞的分離及培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將組織處理器械浸泡于濃度75％乙醇水溶液，再置于無菌操作臺紫外滅菌30min，將器械取出，在無菌操作臺里晾干；
(2)選取1～2月的雄性BALB/c小鼠，頸椎脫臼法處死，置于體積分數75％的乙醇中浸泡2min；
(3)將小鼠腹面向上固定于板上，膝關節局部乙醇消毒，于膝關節正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續向下分離，可見平滑光亮的滑膜組織，用手術剪分離關節囊的滑膜層和纖維層，然后取出滑膜層組織，然后采用同樣方法采集另一側關節滑膜層組織；
(4)將組織放入預冷無菌含雙抗PBS液中，培養皿置于冰上洗滌除去血漬，去除外膜和脂肪組織，無菌條件下在預冷的PBS中用眼科剪將滑膜組織剪成1mm×1mm×1mm的碎塊；
(5)用37℃預熱的II型膠原酶和含二乙烯四乙酸二鈉的胰蛋白酶分別消化，每隔10min吹打一次；
(6)用含大鼠血清、雙抗、胰島素的混合培養基(簡稱混合培養基)終止消化，所得濾液300～400g離心10min，去掉上清液，保留沉淀；
(7)人工貼壁法接種細胞至鋪多聚賴氨酸包被的的培養瓶中；
(8)倒置在37℃、5％CO2培養箱中培養1～2h，使其貼壁，沿孔邊緩慢加入混合培養基，置于37℃、5％CO2環境中繼續培養；
(9)細胞形態及生長情況觀察；
(10)細胞傳代培養；
(11)細胞計數及存活率的測定；
(12)Giemsa染色法進行細胞純度鑒定。
2.根據權利要求1所述的小鼠滑膜細胞的分離及培養方法，其特征在于所用預冷的PBS濃度為0.01M，PH為7.2～7.4。
3.根據權利要求1所述的小鼠滑膜細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(5)所述消化環境為37℃，5％CO2培養箱，0.1％～0.2％的II型膠原酶消化1～2h，再用0.1％～0.2％的胰蛋白酶消化30～40min。
4.根據權利要求3所述的小鼠滑膜細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(5)所述0.15％的II型膠原酶消化1.5h，再用含0.15％的胰蛋白酶消化35min。
5.根據權利要求4所述的小鼠滑膜細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(5)所述的0.15％的胰蛋白酶含有0.01％的二乙烯四乙酸二鈉(EDTANa2)。
6.根據權利要求1所述的小鼠滑膜細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(6)所述的培養基為含10％大鼠血清、含100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的雙抗、4～6μg/ml胰島素的DMEM/F12(1∶1)培養基，pH為7.4。
7.根據權利要求1所述的小鼠滑膜細胞的分離及培養方法，其特征在于步驟(7)所述的培養瓶用3～4μg/cm2的多聚賴氨酸包被，培養條件為37℃、5％CO2培養箱。
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